Ciri-ciri Anti Tumor Ekstrak Buah Delima -Punica Granatum (Pomegranate) Pada Sel-sel Kanser Manusia

Ciri-ciri Anti Tumoral Ekstrak Buah Delima -Punica Granatum (Pomegranate) Pada Sel-sel Kanser Manusia

ABSTRAK

Latar Belakang:

Tanaman ubat, terutamanya contoh yang kaya dengan sebatian polifenolik, telah dicadangkan untuk menjadi chemopreventive berdasarkan sifat antioxidative.

Punica granatum – PG – (buah delima) adalah buah yang terkenal dalam konteks ini, tetapi sitotoksisitasnya dalam sel-sel kanser tidak dikaji secara meluas. Di sini, kita menyiasat sifat antiproliferatif ekstrak kulit buah delima – PG dari Iran dalam sel-sel kanser manusia yang berbeza.

Bahan dan Kaedah:

Satu ekstrak metanol daripada kulit delima (PPE) disediakan. Jumlah kandungan fenolik (TPC) dan jumlah flavonoid content (TFC) ditentukan oleh ujian warna. Aktiviti antioksidan ditentukan oleh aktiviti pemusnahan radikal DPPH. Cytotoxicity dos yang berlainan PPE (0, 5, 20, 100, 250, 500, 1000 μg / ml) telah dinilai oleh ujian MTT dengan A549 (kanser sel kecil bukan paru), MCF-7 (adenocarcinoma payudara), SKOV3 sel kanser ovari), dan sel-sel PC-3 (prostat adenocarcinoma).

Keputusan: Tanda-tanda (P <0.01) atau sangat penting (P <0.0001) diperhatikan berbanding dengan kawalan negatif pada semua dos yang diuji (5-1000 μg / ml). Dalam semua sel kanser yang dikaji, PPE (kulit delima) mengurangkan daya tahan sel kepada nilai di bawah 40%, walaupun pada dos terendah. Dalam semua kes, IC50 ditentukan pada dos di bawah 5μg / ml. Dalam hal ini, sel-sel adenokarsinoma payudara MCF-7 adalah sel-sel yang paling responsif terhadap kesan antiprolifreatif PPE dengan perkrmbangan pertumbuhan min purata 81.0% berbanding 69.4%, 79.3% dan 77.5% di sel SKOV3, PC-3 dan A549 .

Kesimpulan: Dos yang rendah PPE (kulit delima) memberikan kesan anti-proliferatif yang kuat dalam sel-sel kanser manusia yang berbeza dan nampaknya sel adenokarsinoma payudara MCF-7 adalah sel yang paling banyak dan sel-sel kanser SKOV3 selalunya kurang responsif dalam hal ini. Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan perlu ditangani.

PENGENALAN

Oleh kerana pilihan rawatan untuk kanser metastasius yang canggih tetap tidak dapat dipastikan, membangunkan kaedah yang berkesan untuk kanser Figureht telah menjadi matlamat utama untuk mengurangkan beban akibat kanser (Abbasi et al., 2014a). Satu strategi sedemikian adalah melalui chemoprevention, jika mungkin, dengan penggunaan produk semulajadi yang tidak toksik. Dalam hal ini, buah delima yang digunakan selama berabad-abad dalam ubat-ubatan rakyat kini diakui sebagai agen chemopreventive dan antikanser yang berpotensi (Jahanban-Esfahlan et al., 2010; Valiyari et al., 2013; Abbasi et al., 2014b). Punica granatum L. var. spinosa (buah delima) dikenali dari keluarga Punicaceae yang lazimnya terdapat di latitud 475 m di atas paras laut di utara Iran. Punica Granatum (buah delima) telah digunakan secara meluas dalam perubatan tradisional untuk rawatan cirit-birit, disentri, asidosis, helminthiasis, pendarahan dan gangguan pernafasan. Pokok / buah delima terdiri daripada beberapa komponen seperti: benih, jus, kulit, daun, dan akar, masing-masing memiliki aktiviti farmakologi yang menarik (Lansky dan Newman, 2007).

Buah delima kaya dengan sebatian polifenol termasuk isomer punicalagin, derivatif asid ellagic dan anthocyanin (delphinidin, cyanidin dan pelargonidin 3-glucosides dan 3,5-diglucosides) (Elango et al., 2011). Delima terbentuk dari pelbagai jenis unguavonoid yang mengandungi kira-kira 0.2% hingga 1.0% buahnya. Kira-kira 30% daripada semua antosianidin yang terdapat dalam delima terdapat di dalam kulit. Sebatian fenolik poli, serta flavonoid dan tanin banyak terdapat dalam kulit (Singh et al., 2002). Pelbagai pecahan telah diekstrak daripada kulit delima dan biji menggunakan etil asetat, metanol dan air. Telah ditunjukkan bahawa pengekstrakan dengan metanol memberikan hasil yang lebih tinggi dengan aktiviti antioksidan yang lebih besar. Kulit memperlihatkan aktiviti yang lebih tinggi berbanding dengan biji, yang dianggap sebagai komposisi fenoliknya (Syed et al., 2007). Punica Granatum (PG) telah dibuktikan mempunyai kesan antitumor ke atas pelbagai jenis sel kanser dan kandungan fenolik delima yang kaya flavonoid bertanggungjawab untuk aktiviti antikanser.

Walaupun kepekatan anthocyanidins yang tinggi dalam kulit, namun kelaziman yang ada mengenai potensi antikanser buah delima terutama tertumpu pada jus buah atau biji dan data yang sangat sedikit terdapat pada kulit delima (Elango et al., 2011). Buah delima Iran mempunyai kulit merah gelap yang menunjukkan kehadiran anthocyanin yang tinggi dan sebatian polifenol lain. Oleh itu, dalam kajian ini, kami telah memilih kulit buah delima iran untuk menyelidik aktiviti antikarsinogeniknya dalam karsinoma sel paru-paru A549 manusia, sel kanser prostat manusia PC-3, sel-sel kanser sel SKOV3 dan sel kanser adenokarsinoma MCF-7 melalui MTT assay.

Bahan dan Kaedah

1. Penyediaan ekstrak

Buah-buahan buah dipungut dari wilayah Mazandaran, Iran pada tahun 2014. Bahagian-bahagian kulit telah dipisahkan, dikeringkan dan diadunkan dengan serbuk menggunakan pengisar. Pengekstrakan dilakukan dalam alat Soxhlet dengan metanol. Ekstrak itu dihasilkan oleh penyejat berputar dan kemudian dikeringkan dengan tekanan yang sangat rendah. Ekstrak kering disimpan di -20 ° C. Stok 10 mg ekstrak disediakan dalam 1mL dimetil sulfoksida (DMSO) telah menggunakan sebatian picit 0.22mm. Peratusan DMSO dalam percubaan disimpan di bawah 0.5).

2. Penentuan jumlah kandungan fenolik (TPC)

Jumlah kandungan fenolik ditentukan dengan Folin-Ciocalteu Reagent (FCR) mengikut kaedah yang diterangkan (Singleton dan Rossi, 1965) dengan beberapa modifikasi. Briefy, 0.5 ml setiap ekstrak fenolik dicampurkan dengan 2 ml 7.5% natrium karbonat, dan kemudian campuran tersebut didedahkan pada suhu bilik selama 2 minit. Selepas penambahan reaksi Folin-Ciocalteu sebanyak 2.5 ml ten-fold, campuran diinkubasi di dalam bilik gelap selama 30 minit. Penyerapan diukur pada 720 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Hasilnya dinyatakan sebagai mg asid Gallic setiap 100 g jisim segar (mg GAE / 100 g FM). Kurva standard untuk asid Gallic telah diplotkan dalam keadaan yang sama seperti sampel yang dinyatakan. Kesemua penentuan dilakukan dalam tiga kali ganda.

3. Penentuan Kandungan Total Favonoid (TFC)

Jumlah kandungan flavonoid dari ekstrak telah diuji oleh kaedah colorimetrik yang diterangkan oleh penulis lain (Zhishen et al., 1999; Jahanban-Esfahlan et al., 2012) , dengan sedikit modifikasi. CME (250 μl) dicampurkan dengan 1.25 ml air suling dan 75 μl daripada 5% larutan NaNO2. Selepas 5 minit, 150 μl daripada 10% AlCl3. Larutan H2O, 500 μl 1 M NaOH dan 275μl air suling ditambah ke dalam campuran. Penyerapan campuran diukur pada 507 nm. Hasilnya dinyatakan sebagai mg setara dengan Qurcetin per 100 g massa segar (mg Q / 100 g FM) dan dibandingkan dengan lengkung standard Qurcetin, yang dibuat di bawah keadaan yang sama. Kesemua penentuan dilakukan dalam tiga kali.

4. DPPH aktiviti pengarkaan radikal bebas

Aktiviti pemotongan radikal DPPH ditentukan seperti yang dijelaskan oleh Brand-Williams et al. (1995) dengan beberapa pengubahsuaian. Pelbagai jumlah ekstrak (30, 50, 70 dan 100 mL) ditambah kepada penyelesaian 1mL 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (0.1 mM metanol) dan campuran yang digoncang dengan kuat. Selepas inkubasi pada suhu bilik selama 10 minit, penyerapan penyelesaian ini ditentukan pada 517 nm, dengan menggunakan spektrofotometer. Aktiviti antioksidan dinyatakan sebagai nilai IC50, yang dikira oleh regresi tak linear dengan persamaan persamaan exponential fase menggunakan GraphPad Prism versi 6.0.

Sel kanser

SKOV3 (karsinoma ovari manusia), MCF-7 (adenokarsinoma payu dara), PC-3 (prostat adenocarcinima), A549 (sel-sel kans sel sel paru-paru) diperoleh dari Institut Pastur (Tehran-Iran). Sel-sel ditanam di RPMI 1640 ditambah dengan 10% serum janin lembu yang tidak aktif (FBS), penisilin (10 U / ml), streptomycin (10 μg / ml) dan 0.2 mM natrium piruvat. Kultur diinkubasi dengan kehadiran 5% CO2 pada suhu 37 ° C dan 100% relative humidied atmosphere.

MTT assay

Sel yang telah dipilih dalam plat 96-baik dengan ketumpatan 1 × 104 sel / sumur / 200mL dan diinkubasi selama 24 jam pada 37C dan 5% CO2. Sel-sel telah dirawat dengan kepekatan pelarut yang berbeza (5, 20, 100, 250, 500, 1000 μg / ml) dan 0.2% (v / v) DMSO (Merck, Darmstadt, Jerman) sebagai kawalan negatif. Paclitaxel (ubat anti kanser chemotherapeutic yang berasal dari tumbuhan Taxus brevifolia) digunakan sebagai kawalan positif. Selepas rawatan selama 72 jam, 10 mL reagen MTT ditambah kepada setiap tapak uji. Plat diinkubasi letakkan pada suhu 37 ° C dan 5% CO2 untuk 4 jam. Kemudian, 100 mL solubilization ditambah kepada setiap tapak uji dan diikuti dengan inkubasi semalaman pada suhu 37 ° C untuk membubarkan kristal formazan.

Akhirnya, penyerapan dibaca menggunakan pembaca plat ELISA pada panjang gelombang 570 nm. Peratusan sitotoksisiti dan daya tahan sel dikira dengan menggunakan persamaan berikut:% Cytotoxicity = 1- (penyerapan sejagat sel-sel yang dirawat / penyerapan min kawalan negatif) dan% Viability = 100% Cytotoxicity.

Analisis statistik

Semua data yang diwakili dalam kajian ini adalah ± SEM daripada tiga eksperimen yang sama dibuat dalam tiga replika. Keterangan statistik ditentukan dengan analisis varians, diikuti dengan ujian LSD dan p-nilai ≤0.01 dianggap signifikan. Semua analisis dijalankan menggunakan SPSS 16.

Keputusan dan Perbincangan

Dalam dekad-dekad yang lalu, walaupun begitu banyak kejayaan yang dicapai dalam rawatan kanser, namun ia tetap kekal di antara pembunuh paling dominan di dunia (Jahanban Esfahlan et al., 2011). Beban kanser sejagat meningkat kepada 14.1 juta kes baru pada tahun 2012 dan kenaikan kes kanser payudara yang tinggi harus ditangani. Tambahan pula, menurut statistik kanser 2014 di Amerika Syarikat, dikalangan lelaki, kanser prostat, paru-paru dan bronkus, dan colorectum mencakupi kira-kira 50% daripada semua jenis kanser yang baru didiagnosis, dimana kanser prostat sahaja mencakupi 27% (233,000) kes kanser dikalangan lelaki.

Sebaliknya, kanser payudara, paru-paru dan bronkus, dan colorectum, menyumbang satu setengah daripada semua kes di kalangan wanita. Kanser payudara sahaja dijangka mencakupi 29% (232,670) daripada semua kanser baru di kalangan wanita. Secara keseluruhan, kanser paru-paru dan bronkus, prostat, payudara, dan colorectum terus menjadi penyebab kematian kanser yang paling biasa. 4 kanser ini menyumbang hampir separuh jumlah kematian kanser di kalangan lelaki dan wanita, dengan lebih daripada satu perempat daripada semua kematian kanser akibat kanser paru-paru. Keperluan penting dalam mengawal kanser hari ini adalah untuk membangunkan pendekatan yang berkesan dan berpatutan untuk pengesanan awal, diagnosis, dan rawatan kanser (Abbasi et al., 2014c).

Di antara kebanyakan pilihan rawatan, produk semulajadi terutamanya yang kaya dengan antioksidan, sentiasa dianggap sebagai agen kemoterapi yang selamat yang secara berkesan memusnahkan radikal bebas berbahaya dan melindungi sel daripada membentuk pertumbuhan sel yang tidak terkawal dan perkembangan kanser (Abbasi et al., 2014c ). Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) yang berasal dari Iran menunjukkan jumlah yang tinggi iaitu% TFC (103.61 mg Q / 100g FM) dan% TPC (1532.2 mg Q / 100g FM). Selain itu, DPPH IC50 ditentukan 1.5μg / ml Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) yang menunjukkan kepada aktiviti antioksida yang tinggi yang telah disediakan. Keupayaan antioksidan digambarkan secara kuantitatif oleh kepekatan antioksidan yang diperlukan untuk membuang 50% daripada DPPH •, yang disebut IC50. Selanjutnya, kita mengkaji sitotoksisiti selektif Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) pada satu siri kanser manusia termasuk sel-sel kanser ovari (SKOV3), sel adenocarcinoma payudara (MCF-7), sel adenokarsinoma prostat (PC-3) dan sel kanser bukan paru-paru (A549) Ujian MTT.

Dalam usaha kami menetukan pilihan rawatan untuk tumor yang agresif, kami memilih sel-sel kanser ini secara khusus kerana masing-masing memaparkan kecenderungan yang tinggi untuk metastasis di vivo. Ia menunjukkan bahawa sel MCF-7 membentuk tumor apabila disuntik ke dalam tikus athymic. Tumor ini mampu metastasize kepada paru-paru, hati dan limpa. Sel MCF-7 menjernihkan ke dalam kolagenase media kultur yang boleh melengkapkan jenis I dan IV collagens (Shae dan Liotta, 1980). Sebaliknya, sel-sel PC-3 mempunyai potensi metastatik yang tinggi terhadap tulang berbanding dengan sel-sel sel prostat yang lain seperti sel DU145 yang mempunyai potensi metastatik yang sederhana dan sel LNCaP yang mempunyai potensi metastatik rendah (Sanchez-Sweatman et al., 1998) .Sel kecil paru-paru adenocarcinoma adalah tumor pertumbuhan pesat dengan kecenderungan tinggi untuk penularan dan metastasis.

Sel sel ini sering digunakan untuk induksi metastasis paru-paru pada tikus (Shindo-Okada et al., 2002). Sama seperti MCF-7, sel-sel SKOV3 adalah antara kanser ginekologi yang agresif dan yang paling kerap terdapat pada wanita, namun perilaku SKOV3 yang tidak diramalkan berbeza dari sel kanser ER + lain selain MCF-7. Kedua-dua MCF-7 dan SKOV3 mempunyai reseptor untuk estrogen (ER +) dan pada dasarnya mereka perlu berkembang sebagai tindak balas kepada estrogen, namun secara praktikalnya ER + SKOV3 tidak bertindak balas terhadap kedua-dua estrogen dan analognya dan ciri ini menjadikannya calon yang baik untuk meneliti mekanisme oleh yang ER + sel menjadi tidak bertindak balas terhadap terapi estrogen dan anti-estrogen.

Oleh kerana sesetengah polifenol boleh mengganggu aktiviti aromatase dan menghalang sintesis estrogen yang bertindak sebagai faktor utama pertumbuhan sel-sel kanser, jadi kami menggunakan kedua-dua hormon responsif dan sel yang tidak responsif untuk membezakan kesan terpilih ekstrak polifenol tinggi buah PG pada sel-sel ini . Keputusan kami menunjukkan bahawa dalam semua dos, perbezaan yang signifikan atau sangat jelas diperhatikan antara kumpulan yang dirawat dan tidak dirawat dalam dos yang bebas (Rajah1,2). Di semua sel-sel, 5μg / ml PPE menyebabkan penyumbatan pertumbuhan ≥50% dalam sel-sel yang dirawat yang menyumbang kepada ketoksikan tinggi 60% metanol ekstrak PS (Table1). Dalam kes sel kanser ovari, perencatan pertumbuhan maksimum sebanyak 78.2% diperolehi pada dos 100 μg / ml.

Di dalam sel sel ini, Toxol 20μg / ml (kawalan positif) yang menyebabkan perencatan pertumbuhan 93.76% pada sel kanser SKOV3. Sebaliknya, dos 5μg / ml dan 500μg / ml Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) menyebabkan perencatan pertumbuhan paling rendah iaitu 63.78% dan 63.41%. Penghambatan pertumbuhan min di dalam sel-sel ini ialah 69.43%. Dalam sel-sel kanser MCF-7, perencatan pertumbuhan maksimum sebanyak 83.7% diperoleh pada dos 5μg / ml, nilai yang setanding dengan Toxol 20 μg / ml yang menyebabkan perencatan pertumbuhan 95.1% sel adenocarcinoma payudara MCF-7. Perencatan pertumbuhan terendah sebanyak 76.54% diperoleh pada dos 500μg / ml Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) . Pencapaian pertumbuhan min adalah 82.76% (Jadual 1, Rajah 2) Di dalam sel-sel adenokarsinoma prostat,

Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) menyebabkan perencatan pertumbuhan maksimum sebanyak 84.16% dan 84.0% pada dos 250μg / ml dan 500μg / ml. Di dalam sel sel ini, Toxicol 20μg / ml menyebabkan 93.1% penghambatan pertumbuhan sel-sel kanser PC-3 manakala dos 20μg / ml Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) menyebabkan pertumbuhan terendah sebanyak 73.7%. Penghambatan pertumbuhan min di dalam sel-sel ini ialah 78.3% (Jadual 1, Rajah 2). Dalam kes sel-sel kanser A549, perencatan pertumbuhan maksimum sebanyak 80.0% diperolehi pada dos 250μg / ml. 20μg / ml Toxol disebabkan oleh perencatan pertumbuhan sebanyak 90.25% A549 sel. Di dalam sel-sel ini, dos 5μg / ml, 20μg / ml, 100μg / ml dan 500μg / ml menyebabkan perencatan pertumbuhan paling rendah ~ 76.0%. Kadar pertumbuhan dalam sel-sel ini adalah 77.46% (Jadual 1, Rajah 2). Berbeza dengan aktiviti antioksidan yang tinggi dari kulit buah, ada beberapa kajian yang bertujuan menilai sitotoksisinya. Dalam kajian oleh Elango et al pada tahun 2011, analisis GC-MS terhadap ekstrak metanol dari kulit delima dari varity Kabul menunjukkan sejumlah enam senyawa. Antara enam sebatian, GA didapati hadir dalam kuantiti yang lebih tinggi yang diikuti oleh EA dan quercetin. Berikutan itu, ketoksikan GA dinilai pada sel-sel kanser A549 oleh MTT dan apoptosis assay.

Dalam kajian ini, kami mendapati peningkatan spesies oksigen reaktif dalam sel yang dirawat dengan GA pada kepekatan 10 dan 20 μg / ml. Selain itu, ujian MTT menunjukkan bahawa GA mengurangkan daya tahan sel kepada nilai-nilai yang lebih rendah kemudian 50% pada dos 20μg / ml (Elango et al., 2011). Dalam kajian lain oleh Sine Sepehr et al. (2012), penulis mengkaji sitotoksisiti dan kesan apoptotik dari Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) dan ekstrak PSE terhadap buah delima Iran dalam percambahan sel PC-3.

Dalam kajian ini, Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) menyebabkan perencatan pertumbuhan maksimum sebanyak 65% pada dos 600μg / ml. IC50 diperoleh pada dos 250.21μg / mL dalam sel-sel kanser ini. Dalam percubaan kami, dalam dos bebas, Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) menyebabkan perencatan pertumbuhan maksimum sebanyak 84.16% pada dos 250μg / ml, nilai-nilai yang setanding dengan Toxol 20μg / ml dengan perencatan pertumbuhan 93.1% pada sel PC-3. Selain itu, IC50 (dos untuk menyekat pertumbuhan sel 50%) ditentukan pada dos di bawah 5μg / ml.

Perbezaan ini boleh dikaitkan dengan potensi antioksidan ekstrak yang disediakan, sebagai ekstrak etanol yang kami gunakan  di atas menunjukkan kandungan polifenol yang lebih rendah berbanding ekstrak metanol yang digunakan dalam kajian kami. Terutama, tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara sitotoksisiti dos yang berbeza dan juga dalam kes sel MCF-7, dos 5μg / ml menyebabkan lebih banyak penindasan berbanding 500μg / ml yang menunjukkan bahawa dos biologi optimum adalah lebih penting dan relevan daripada yang diterima maksima.

Selain itu, hasil ujikaji kami menunjukkan bahawa dalam semua sel kanser, Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) mengurangkan daya tahan sel kepada nilai di bawah 40%, walaupun dos terendah. Dalam hal ini, sel-sel adenocarcinoma payudara MCF-7 adalah sel-sel yang paling responsif terhadap kesan antiprolifreatif PPE dengan penghambatan pertumbuhan min purata 81.03% berbanding 69.43%, 79.3%, 77.46% dalam sel SKOV3, PC-3 dan A549 . Seolah-olah sel SKOV3 sel kanser ovari adalah sel yang kurang responsif kepada sifat-sifat sitotoksik Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) berbanding sel-sel kanser yang dikaji.

Pengendalian ini sebahagiannya dapat dijelaskan oleh responsif yang berbeza dari sel-sel kanser yang dikaji kepada aktiviti anti-estrogenik senyawa polifenol dan flavonoid dalam PPE yang boleh mengganggu aktiviti aromatase dan menghalang sintesis estrogen yang bertindak sebagai faktor pertumbuhan pada sel-sel yang mewakili reseptor esterogen serta MCF-7 dan SKOV3 (Balunas et al., 2008).

Walau bagaimanapun, sebaliknya, walaupun kanser ovari SKOV3 adalah ER + tetapi proliferasi mereka tidak bergantung kepada estrogen, jadi sel-sel ini kurang sensitif terhadap aktiviti antiprolifreatif PPE berbanding dengan sel-sel kanser estrogen dan androgen sensitif yang lain termasuk sel kanser MCF-7, PC-3 dan A549.

Keputusan penyelidikan kami menunjukkan bahawa ekstrak hydoalcholic Ekstrak Kulit Buah Delima (PPE) mempunyai potensi yang tinggi untuk menghalang percambahan sel-sel tumor yang berbeza dalam dos yang bebas yang memerlukan pengoptimuman dos yang tepat. Tambahan pula, kesan antiprolifreatif PPE seolah-olah jenis spesifik tumor, kerana sel-sel kanser bergantung hormon menunjukkan respons yang tinggi terhadap kesan antitumoral ekstrak ini.

Journal oleh: Modaeinama S¹, Abasi M², Abbasi MM³, Jahanban-Esfahlan R⁴.

1 Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, 2 Department of Medical Biotechnology, Faculty of Advanced Medical Sciences, 3 Student Research Committee, 4 Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran *For correspondence: jahanbanr@tbzmed.ac.ir

Sumber asal: www.researchgate.net/publication/281395016