Bahan Perencat Molikul Kecil Replikasi Virus HCV Dari Ekstrak Buah Delima

Virus Hepatitis C (HCV) adalah agen penyebab penyakit hati peringkat akhir. Kemajuan terkini  dalam strategi rawatan anti HCV telah meningkat secara mendadak. Walau bagaimanapun, beberapa batasan masih dikaitkan, yang memerlukan penyelidikan untuk ubat yang baru, selamat dan terpilih terhadap jangkitan HCV. Ke arah matlamat ini, kami meneroka perencat molekul kecil yang sangat kuat dan terpilih iaitu ellagitannins, dari ekstrak mentah buah delima (Punica granatum). Sebatian tulen, punicalagin, punicalin, dan asid ellagik yang diasingkan dari ekstrak tersebut secara khusus menyekat aktiviti protease HCV NS3 / 4A dalam vitro.

Analisis struktur menggunakan pendekatan komputasi juga menunjukkan bahawa molekul ligand berinteraksi dengan residu pengikat katalitik dan substrat NS3 / 4A protease, yang membawa kepada perencatan aktiviti enzim. Selanjutnya, punicalagin dan punicalin dapat mengurangkan replikasi HCV dalam sistem kultur sel. Lebih penting lagi, sebatian-sebatian ini dapat diterima dengan baik oleh ex vivo dan’no mengesan kesan buruk ‘(NOAEL) didirikan sehingga dos akut 5000 mg / kg dalam tikus BALB / c. Selain itu, kajian farmakokinetik menunjukkan bahawa sebatian bioavailable. Diambil bersama, kajian kami menyediakan pendekatan bukti-konsep untuk potensi penggunaan prinsip-prinsip antiviral dan non-toxic ellagitannins dari buah delima dalam pencegahan dan kawalan komplikasi yang disebabkan oleh HCV.

Virus Hepatitis C (HCV) adalah salah satu penyebab utama penyakit hati kronik. Dianggarkan bahawa sekitar 170 juta orang dijangkiti kronik HCV di seluruh dunia 1. Jangkitan kronik HCV dikaitkan dengan penyahkawalseliaan mekanisme isyarat semula jadi dan penyesuaianpenyebab  imun serta virus sitotoksis.

Kesilapan yang terdedah kepada replikasi genomik virus dalam persekitaran mikro hati membenarkan pengongsian imun dan memudahkan ketekunan virus, yang seterusnya mendorong perkembangan fibrosis hati, sirosis dan karsinoma hepatosel ². RNA HCV yang pesat berkembang membawa kepada cabaran untuk perkembangan terapi antiviral tertentu terhadap semua genotype virus. Terapi semasa termasuk kombinasi pegylated IFN-α (pegIFN-α) dan ribavirin dengan baik telaprevir atau boceprevir telah meningkatkan dengan ketara tindak balas virus (SVR) dalam pesakit yang dijangkiti genotip 1. Walau bagaimanapun, terapi ini mengalami beberapa batasan tambahan. Khususnya, penurunan viral load yang perlahan semasa terapi tiga kali ganda mempunyai risiko tinggi untuk pemilihan rintangan yang berkaitan dengan variasi ³. Oleh itu, perkembangan ubat-ubatan yang lebih kuat, selamat, imun dan dapat diterima dengan baik adalah keperluan masa kini.

Sebilangan besar komponen semulajadi atau komponen diet mampu memodulasi isyarat mitogenik, pengawalan kitaran sel, angiogenesis, apoptosis dan metastasis ⁴. Beberapa komponen pemakanan tumbuhan yang diperolehi telah diterokai untuk kebolehan mereka untuk mengganggu semua kemungkinan peringkat kitaran hayat HCV melalui mekanisme yang berbeza dan terbukti bernilai untuk terapi HCV. Baru-baru ini, naringenin (anggur) telah ditunjukkan untuk menghalang rembesan apolipoprotein B yang bergantung kepada partikel HCV⁵.  Proanthocyanidin (blueberry) menghalang replikasi HCV, mungkin dengan berinteraksi dengan hnRNP A2 / B 6. Curcumin (kunyit) menghalang replikasi HCV melalui penekanan jalur AKT SREBP-1 7 dan kemasukan semua genotip HCV ke sel-sel hati manusia ⁸. Epigallocatechin-3-gallate (teh hijau) menghalang kemasukan HCV ⁹. Juga, epicatechin fenolik (+/-) menghalang replikasi HCV melalui laluan siklooksigenase-2 ¹⁰. Begitu juga, quercetin telah menunjukkan menghalang HCV dengan mensasarkan protein kejutan haba sel, HSPs 40 dan 70 ¹¹. Ia juga membatalkan aktiviti protease HCV NS3 / 4A dalam vitro serta ex vivo ¹².

Pomegranate (Punica granatum) adalah salah satu buah  yang digunakan di seluruh dunia. Dalam perubatan Ayurveda, ia digambarkan di bawah nama ‘dalima’ Sanskrit (buah) sebagai pembersih darah ¹³. Ia telah digunakan selama berabad-abad untuk rawatan pelbagai gangguan kesihatan. Selain aktiviti anti-radang dan anti-kanser ¹⁴, ia menghalang jangkitan virus, seperti HIV ^15,16 influenza¹⁷, enterovirus ¹⁸  dan sebagainya. Kulit buah delima, yang terdiri daripada hampir 26-30% daripada jumlah berat buah, diperkayakan dengan hidrolisis tanin (punicalin, pedunculagin, punicalagin, asid ellagic dan asid gallic), anthocyanin dan catechin. Senyawa ini menyumbang 92% daripada aktiviti antioksidan^19,20. Ekstrak buah granatum P tidak menyebabkan kesan sampingan dan tidak diketahui untuk interaksi ubat; Sebaliknya ia menghalang fibrosis ²¹. hati. Walau bagaimanapun, analisis sistematik terhadap sifat-sifat anti-HCV P. granatum dan prinsipnya ellagitannin ahli belum dipelajari setakat ini. Dalam konteks ini, kami mengkaji sifat-sifat anti-HCV ekstrak kulit buah P. granatum dan derivatif ellagitannin, punicalin (PLN), punicalagin (PGN) dan asid ellagic (EA). Senyawa-senyawa ini memperlihatkan perencatan bergantung kepada HCV NS3 / 4A aktiviti protease dalam vitro dan pengurangan RNA HCV dalam subunit replika HCV dan sistem sel sel berjangkit menggunakan HCV-JFH1 (genotype-2a) virus dan H77S (genotype-1a) RNA. Menariknya, sebatian aktif ini didapati secara sistematik bioavailable dan disahkan dengan baik sehingga 5000 mg / kg b.wt dalam tikus BALB / c dan memenuhi semua keperluan untuk menjadi molekul terapeutik anti-HCV yang kuat.

Keputusan
Pengenalpastian sebatian bioaktif dari kulit buah delima berdasarkan kaedah berpandu bioassay
Ekstrak methanolic mentah (~ 90%) dari kulit buah dan jus buah delima dinilai untuk aktiviti protease anti-HCV NS3 mereka. Walaupun kedua-dua ekstrak kulit dan jus menunjukkan perencatan aktiviti protease NS3, tetapi ekstrak kulit didapati lebih berkesan daripada ekstrak jus (Fig. 1A) Tambahan pula, HPLC menganalisis ekstrak methanolic mentah kulit P. granatum mengungkap punicalin (PLN), punicalagin (PGN) dan asid ellagic (EA) sebagai pengadun utama (Supplementary Fig. S1). Selepas itu, ekstrak kulit ini dibahagikan dengan n-heksana (pecahan-1), kloroform (pecahan-2), dan etil asetat (pecahan-3) dalam kecerunan polar (Supplementary Fig. S2A) dan tertumpu. Fraksi ini (pecahan1-3) dan meninggalkan sisa (residu-3) dinilai untuk potensi mereka untuk menghalang aktiviti protease HCV NS3. Antara berikut, pecahan residu (residu-3) dikenal pasti sebagai biologi paling aktif dalam menghalang protease NS3 (Rajah 1B dan Jadual 1). Menariknya, analisis HPLC bagi pecahan sisa ini juga menunjukkan kehadiran PLN, PGN dan EA sebagai komponen utama (Supplementary Fig. S2B). Pecahan sisa-3 telah dikecilkan lagi oleh kromatografi lajur pengecualian saiz. PLN, PGN disingkirkan secara berurutan di dalam air (sub-pecahan 1A & 1B) yang menunjukkan bahawa ini adalah sebatian polar yang tinggi manakala EA dielakkan dalam alkohol (sub-pecahan 2A) dan aseton (sub-pecahan 3A & 3B). Sub-pecahan ini tertumpu oleh penyejat berputar. Identiti sebatian yang disucikan ini telah disahkan oleh LC ESI-MS  (Supplementary Fig. S3–S5), dan telah disahkan oleh kajian spektroskopi NMR, IR dan UV (data tidak ditunjukkan). Senyawa-senyawa yang disucikan ini selanjutnya dinilai untuk sifat anti-HCV mereka.

PLN, PGN dan EA menyekat aktiviti protease HCV NS3 / 4A dalam vitro
PGN, PLN dan EA yang telah disucikan telah diuji untuk menghalang aktiviti protease NS3. Semua senyawa ini menghalang aktiviti protease NS3 / 4A dalam cara bergantung kepekatan dengan nilai IC50 kurang daripada 0.1 μM untuk PGN dan PLN, sedangkan IC50 untuk EA dicapai pada ~ 1.0 μM  (Fig. 1C and Table 1).

Kami juga membandingkan potensi penghalang makmal yang disucikan dengan kompaun yang diperoleh secara komersil  (Fig. 1C dan Supplementary Fig. S6A). Tidak terdapat perbezaan yang besar dalam aktiviti penghambatan sebatian ini yang diperoleh dari dua sumber yang berlainan.

Untuk menjelaskan sama ada hanya PGN, PLN, dan EA adalah pemain utama dari ekstrak buah delima yang menghalang aktiviti protease NS3, kami telah menguji tiga belas lagi sebatian tulen (quercetin, luteolin, catechin, epicatechin, asid gallic, asid caffeic, kaempferol, 3 , Asid 3′-O-methyl ellagic -4′-O-β-D-xylopyranoside, apigenin, methyl gallate, rutin, asid ferulik dan asid asidatik) yang terdapat di P. granatum, untuk aktiviti protease anti HCV-NS3. Sesetengah sebatian ini (seperti quercetin, dan luteolin) menunjukkan perencatan yang besar, walaupun pada beberapa lipatan kepekatan yang lebih tinggi daripada yang diperlukan oleh PGN, PLN, dan EA (Supplementary Fig. S6B dan Fig. 1C). Juga, tahap sebatian ini (seperti quercetin, dan luteolin) tidak banyak di delima. Pengamatan kami menunjukkan bahawa PGN, PLN, dan EA adalah penyumbang utama yang terdapat dalam ekstrak kulit buah P. granatum yang menghalang protease HCV NS3.

Di samping itu, untuk menunjukkan kekhususan sebatian ini kepada protease HCV NS3, kami telah menganalisis kesan sebatian ini pada aktiviti trypsin (protease serina selina pankreas yang tidak berkaitan) menggunakan ujian fluorometrik (Fig. 1D). Pemerhatian kami dengan jelas menunjukkan bahawa ellagitanin ini tidak mempunyai sebarang kesan perencat pada aktiviti protease trifsin selular sehingga 25 μM.

Asas struktur HCV NS3 / 4A inhibisi protease oleh PGN, PLN dan EA
Analisis eksperimen semasa menunjukkan perencatan protease NS3 oleh PLN, PGN dan EA. Asas struktur interaksi ligan yang menarik dengan protease HCV NS3 juga dikaji untuk memahami asas penghalang molekul. Ligand yang serupa dengan PLN, PGN dan EA didapati terikat pada protein seperti protease terutamanya serine protease (PDB id: 1dy8, 1dy9, 1bma, 1btx, 1eld, 1ele, 1fpc, 1p01, 2est). Malah, salah satu daripada protease serine termasuk protease HCV NS3 terikat kepada perencat α-ketoacid (1y8, 1dy9) ²².. Menariknya, analisis menunjukkan bahawa semua protease serine telah dihalang di rantau pemangkin dan rintangan mengikat substrat (perencatan kompetitif). Juga, persamaan atom oxy dalam ligan protease serina meningkat dan ligan-ligan yang menarik diperhatikan, di mana kumpulan oxy berinteraksi dengan residu katalitik S139. Analisis ini menimbulkan kemungkinan ligan yang berinteraksi dengan protease NS3 seperti protease bound bound serine yang dibandingkan.

Hasil dok menunjukkan bahawa ligan kepentingan sememangnya didapati berinteraksi dengan dua daripada tiga residu triad katalitik ²³  iaitu S139 dan H57. C dan atom O semua ligan berinteraksi dengan H57 melalui ikatan hidrofobik dan hidrogen. C dan atom O semua ligan berinteraksi dengan S139 melalui ikatan hidrogen yang konsisten dengan kompleks terikat NS3-ligand yang diambil. Selain itu, sesetengah substrat yang berinteraksi dengan residu ²³  (L135, F154, R155, A156, A157, V158 dan R161) bersama-sama dengan sisa-sisa lain dalam NS3 juga didapati berinteraksi dengan semua ligan kepentingan seperti yang ditunjukkan dalam Fig. 2. Beberapa interaksi yang ketara adalah F154 yang membuat hubungan aromatik aromatik dengan kumpulan C, O dengan semua ligan, A156 dan A157 yang menjadikan hubungan hidrofobik dengan kumpulan C dan O masing-masing dengan ligan, R135 yang menjadikan ikatan hidrogen dengan kumpulan C, O kumpulan punicalin dan punicalagin. Sisa lain dalam NS3 yang berinteraksi dengan semua ligan adalah V132, K136 dan C159. Tenaga yang mengikat NS3 yang terikat kepada PLN, PGN dan EA didapati -3.33 Kcal / mol, -4.46 Kcal / mol dan -5.91 Kcal / mol masing-masing. Nilai-nilai tenaga yang mengikat ini menunjukkan interaksi yang menggalakkan dengan kompleks protein-ligand. Nilai pemalar KI atau perencatan untuk semua kompleks terikat NS3 dijangka berada dalam kepekatan mikromolar Fig. 2. Analisis ini mencadangkan bahawa PLN, PGN dan EA dapat berinteraksi baik dengan residu triad pemangkin dan residu substrat yang berinteraksi dengan substrat NS3, sehingga menyebabkan perencatan enzim.

Struktur kristal NS3 terikat pada penghawa NS3 yang diluluskan secara klinikal – ‘telaprevir’ (PDB id: 3sv6) 24 tersedia. Bagaimanapun, untuk mencapai idea ketepatan struktur kompleks yang dipodelkan, kami telah menghasilkan model protease NS3 yang terikat kepada telaprevir (Supplementary Fig. S7) menggunakan protokol yang diterangkan dalam bahagian kaedah. Perlu diingatkan bahawa kami tidak menggunakan sebarang maklumat dari struktur Kristal kompleks NS3-telaprevir. Sebaik sahaja model kompleks dihasilkan, ia dibandingkan dengan struktur kristal supaya ketepatan model dapat dipastikan  (Supplementary information and Supplementary table S1). Seperti yang dapat dilihat dari supplementary section beberapa ciri yang terdapat dalam struktur Kristal kompleks NS3-telaprevir juga terdapat dalam kompleks model.

Telah diketahui dengan jelas bahawa poket mengikat ligan dalam protease HCV NS3 adalah cetek dan pelarut terdedah ²³.. Walau bagaimanapun, ia telah diketahui dari struktur kristal yang telaprevir mampu berinteraksi dengan NS3 melalui rangkaian interaksi yang luas yang merangkumi kedua-dua substrat mengikat dan residu pemangkin. Kajian semasa menunjukkan bahawa kaedah pencerobohan yang sama juga telah digunakan oleh punicalin, punicalagin dan asid ellagic untuk berjaya mengikat dan menghalang poket mengikat cetek NS3 protease.

Selain itu, asas struktur untuk ketidakstabilan ligan untuk menghalang porcine peptinic trypsin (kod PDB untuk struktur 3-D porcine trypsin: 1s81) ²⁵  telah diterokai. Kerana kedua-dua protease NS3 (keluarga SCOP: b.47.1.3 – protease virus) ²⁶  dan trypsin pankreas porcine (keluarga SCOP: b.47.1.2 – protease eukariotik) tergolong dalam keluarga yang berbeza daripada SCOP superfamily yang sama (SCOP superfamily: b. 47.1 – trypsin seperti protease serine), mereka boleh dianggap sebagai homolog jauh. Oleh itu, adalah selamat untuk menganggap bahawa ligan mengikat, jika ia mengikat, kepada trypsin akan sama dengan ligand yang mengikat kepada protease NS3.

NS3 protease-ligand modelled complex (Fig. 2) has been used to identify the ligand interacting residues in NS3 protease. Trypsin was structurally aligned²⁷ with the NS3 protease bound to ligand molecule and the interface between trypsin and the ligand molecule was studied.

Kami perhatikan kehilangan interaksi, berbanding dengan kompleks protease NS3, disebabkan oleh penggantian asid amino (Sebagai contoh: hidrofobik untuk asid amino yang dikenakan), kehadiran hubungan pendek dan perubahan dalam pengesahan dalam trypsin dengan interaksinya terhadap ligan. (Untuk penilaian terperinci interaksi antara trypsin dan ligan merujuk Supplementary tables S2, S3 and S4). Sudah diketahui bahawa saku S1 protease NS3 adalah hidrofobik (L135, F154, A157) 23 dan beberapa residu juga didapati berinteraksi dengan ligan dalam struktur komplek NS3-ligand. Bagaimanapun, residu yang sama dalam trypsin digantikan dengan asid amino yang tidak sesuai untuk interaksi dengan ligan. Contohnya Ala 157 dari NS3 digantikan oleh Trp dalam poros trypsin yang membawa kepada sentuhan pendek dengan ligan. Satu lagi kes penggantian Leu 135 dalam NS3 kepada cysteine ​​dalam trypsin yang disulfida yang terikat dengan cysteine ​​yang lain telah diperhatikan. (Supplementary tables S2–S4). Walaupun kedua-dua protease NS3 dan trypsin menjadi homolog jauh, beberapa ciri struktur dan fizikokimia yang tidak menyenangkan dapat menghalang interaksi molekul ligand dengan trypsin, sehingga tidak menjejaskan aktiviti trypsinnya.
Kesan PLN, PGN dan EA terhadap replikasi RNA HCV dan kemasukan virus
Kami selanjutnya menilai peranan penghalang PLN, PGN dan EA terhadap replikasi RNA HCV. Huh7 sel-sel yang melindungi genotip-2a replika monocistronic HCV digunakan untuk tujuan ini. Kecekapan replikasi dinilai dengan menggunakan RT-PCR masa nyata pada penambahan penghantar penambahan 48 jam. Ia terbukti dari hasil yang PGN, PLN, EA mengurangkan tahap RNA untai negatif HCV dalam cara yang bergantung kepada dos (Supplementary Fig. S8A). Kepekatan berkesan (EC50) sebatian ini disenaraikan dalam Table 2.

.Kesan penghambatan sebatian juga ditunjukkan dengan vivo dengan menggunakan sistem kultur sel berjangkit genotip 2a (JFH1) atau genotip 1a (H77S)  (Fig. 3A and 3B). Keputusan menunjukkan bahawa sebatian ini menghalang replikasi HCV kedua-dua genotip. Oleh kerana diketahui bahawa RT-PCR kuantitatif sahaja tidak mempunyai kekhususan spesifik untuk HCV ²⁹, kami menggunakan kaedah RT-PCR yang lebih tegas dengan tag tegar spesifik strand30 dan mengesahkan kesan penindasan replikasi sebatian pengujian (Supplementary Fig. S8B).

Seperti yang diperhatikan di atas bahawa ellagitannins ini mereplikasi replikasi HCV, seterusnya kita telah menyiasat kesan sebatian ini pada kemasukan HCV (jika ada). Untuk ini, Huh7.5 sel telah diulang semula pada suhu 4 ° C dan pretreated dengan virus JFH1 dan beralih kepada 37 ° C selama 3 jam dengan kehadiran sebatian (150 μM setiap satu) diikuti oleh perubahan media. Pada 72 jam selepas rawatan RNA selular telah diasingkan dan paras RNA virus dikira oleh PCR masa sebenar. Keputusan menunjukkan perencatan yang kuat dari kemasukan HCV oleh PLN dan PGN (Fig. 3C).

Untuk mengesahkan sama ada pengurangan replikasi HCV RNA oleh ellagitannins ini disebabkan oleh pengaktifan isyarat interferon selular (IFN) atau tidak, kami telah merawat sel-sel yang dijangkiti HCV-JFH1 dengan PGN, PLN atau IFNα dan memeriksa ekspresi transducer isyarat fosforilasi dan pengaktifan transkripsi 1 (pSTAT 1). PGN dan PLN tidak menunjukkan bentuk phosphorylated yang ketara STAT 1 berbanding dengan rawatan IFNα. Data kami menunjukkan bahawa penindasan PGN atau PLN yang ditengahi oleh replikasi RNA HCV mungkin tidak disebabkan oleh pengaktifan laluan isyarat IFN selular (Supplementary Fig. S8C).

PGN, PLN dan EA adalah tidak aktif dalam sel kultur
Untuk mengkaji ketoksikan selular sebatian ini (jika ada), kami menguji kesan ekstrak kulit buah mentah (CE), pecahan sisa (Res 3), PGN, PLN dan EA pada daya maju sel. Untuk tujuan ini, sel-sel Huh7 atau Huh7 yang menampung replika 2a sel telah dirawat 0-2.5 mg / mL CE & Res-3 (RF), dan 0-5 mM sama ada PGN, PLN atau EA (Fig. 4A, 4B dan Supplementary Fig. S9). Keputusan menunjukkan bahawa sebatian ini tidak toksik kepada sel-sel. Senyawa-senyawa ini menyelamatkan kematian sel JFH1 yang dijangkiti Huh7.5 sel (Fig. 4C), menunjukkan bahawa sebatian ini tidak menular dalam sel kultur.

Tiada kesan sampingan diperhatikan dalam ketoksikan akut oral dalam vivo
Seterusnya, kami menyiasat tahap toleransi maksimum ekstrak mentah (CE) dan sebatian disucikan dalam tikus BALB / c. Haiwan yang diberikan dengan dos akut 2000 mg / kg b.wt. tidak menunjukkan gejala buruk dari segi berat badan, pengambilan air dan makanan, tingkah laku am, dan kematian sehingga 14 hari selepas tempoh rawatan(Supplementary Fig. S10A). Tambahan pula, peningkatan kepekatan PLN, PGN dan EA sehingga 5000 mg / kg b.wt, tidak menyebabkan sebarang tanda-tanda toksik dan menunjukkan tahap toleransi yang tinggi dengan peningkatan berat badan (Supplementary Fig. S10B). Selain itu, morfologi organ kasar dan berat badan penting (hati dan limpa) dalam tikus BALB / c tidak berubah (Supplementary table S5). LD50 untuk pentadbiran oral PGN, PLN dan EA dianggarkan> 5000 mg / Kg.

Sebaliknya, sedikit penurunan dalam kadar survival diperhatikan apabila 5000 mg / kg b.wt. CE diberikan kepada tikus. Walaupun tiada kematian tertunda diperhatikan tetapi kira-kira 30% kematian antara 24 hingga 72 jam telah diperhatikan (Supplementary table S5). menunjukkan bahawa sebatian selain PGN, PLN dan EA di CE mungkin bertanggungjawab untuk mendorong keracunan pada tikus. Diambil bersama, mengikut Sistem Klasifikasi Harmonisasi Global (GHS) yang disebut dalam garis panduan OECD-423, PLN, PGN dan EA boleh dikelaskan ke dalam kategori-5 ∞ (iaitu tidak dikelaskan) yang menunjukkan bahawa sebatian ini dianggap selamat dan tidak mempunyai ketoksikan .

Tiada kesan sampingan diperhatikan dalam ujian ketoksikan subakut dalam vivo
Pengambilan oral PGN, PLN dan EA pada 1000 mg / kg b.wt./day selama 28 hari secara berasingan kepada tiga kumpulan yang berbeza tidak menyebabkan sebarang gejala toksik yang jelas (Supplementary Fig. S10C). Selain itu, tiada perbezaan diperhatikan dalam berat organ relatif hati yang dibedah dan limpa antara kumpulan yang dirawat dan kawalan (Supplementary table S6).

Pemeriksaan histologi hati tikus dan limpa menunjukkan histoarkitektur biasa
Analisis histopatologi bahagian-bahagian kawalan hati (air sulingan steril) dan tikus yang dirawat dengan CE, PLN, PGN dan EA (dos akut 2000 dan 5000 mg / kg b.wt.) menunjukkan histoarkitektur biasa berkenaan dengan bentuk poligonal hepatosit, nukleus bulat jelas, urat tengah, sinusoid darah, urat portal (Fig. 5A). Begitu juga, tidak terdapat gejala patologi dalam bahagian limpa (Supplementary Fig. S11).

Penilaian ketoksikan lanjut PLN dan PGN dalam kajian ketoksikan subakut juga tidak mendedahkan apa-apa perubahan dalam histoarkitektur hati dan tisu limpa selepas 28 hari berulang pentadbiran 1000 mg / kg / hari. Walau bagaimanapun, hanya sekurang-kurangnya nokrosis hepatoselular multifokal yang diperhatikan dalam histologi hati apabila rawatan EA selama 28 hari (Fig. 5A and Supplementary Fig. S11).

Pengambilan Oral PGN, PLN dan EA secara sistematik bioavailable
Untuk kompaun untuk mencapai tisu untuk menghasilkan kesannya, ia mesti dibawa ke aliran darah sebelum diambil oleh sel sasaran. Oleh itu, adalah penting untuk menguji ketersediaan bio PGN, PLN dan EA dalam darah. Untuk tujuan ini, ketiga-tiga sebatian telah diberikan secara oral pada 1000 mg / kg b.wt. Berdasarkan analisis HPLC, hanya EA dikesan dalam kepekatan yang berbeza-beza dengan sampel plasma tikus PGN, PLN dan EA yang dirawat. Dalam tiada sampel plasma, bentuk-bentuk sebatian PGN dan PLN yang utuh dikesan. Ini mungkin disebabkan oleh metabolisme pesat PGN dan PLN ke EA aktif dengan tindakan pelbagai enzim pencernaan dan mikroflora usus. Menariknya, peningkatan relatif sebanyak 1.9 dan 1.6 liputan dalam penyerapan EA dilihat pada kumpulan yang diberikan oleh PLN (Cmax = 5.5 μg / mL) dan PGN (Cmax = 4.8 μg / mL) dibandingkan dengan EA (Cmax = 2.9 μg / mL) sampel plasma dan EA ini diserap dengan cepat dari darah pada 4hb. Ini meningkatkan kepekatan EA dalam PGN, sampel plasma yang dirawat oleh PLN mungkin disebabkan oleh kutub yang lebih tinggi dan kelarutan yang lebih tinggi kedua-dua sebatian ini dalam air daripada EA. Tiada puncak EA yang sesuai dikesan dalam plasma yang dikumpulkan sebelum penggunaan komponen-komponen ini (titik masa jam ke-0) (Fig. 5B). Diambil bersama, penilaian farmakokinetik kami mendedahkan bahawa sebatian ini diserap secara sistemik dari saluran gastrointestinal ke plasma darah.

Perbincangan
Rawatan berasaskan tumbuhan mempunyai sejarah yang panjang dalam rawatan pelbagai penyakit termasuk jangkitan virus dan penyakit hati. Sebatian tumbuhan yang diperolehi dianggap unik kerana kepelbagaian kimianya yang tinggi, ciri-ciri ubat-ubatan, kekhususan biokimia kepada ujian enzimatik virus yang berlainan, dan kapasiti diserap dan dimetabolisme oleh badan dengan sedikit atau tiada ketoksikan daripada yang sintetik ³¹. Selain itu, kemajuan kaedah penulenan dan pencirian sebatian aktif menjadi lebih berguna dalam penyaringan spektrum luas perpustakaan sebatian turunan tumbuhan untuk terapi anti-HCV.

Kajian semasa kami merangkumi proses penjelasan yang logik dan langkah untuk meneroka peranan ellagitannins imun yang berasal dari buah delima  dalam menindas jangkitan HCV. Protein HCV NS3, chimera helicase dan serine protease, terlibat dalam pemprosesan poliprotein virus dan replikasi. Protein ini merampas jentera selular tuan rumah melalui meniru protein sel tuan rumah dan mengganggu secara langsung isyarat antivirus TLR-3 dan RIG-I yang seterusnya menyebabkan penindasan tindak balas imun semula jadi ^32,33. Eksperimen in vitro kami menunjukkan bahawa komponen prinsip P. granatum, PGN, PLN, dan EA menghalang fungsi aktiviti protease dengan bertindak secara langsung terhadap protease HCV NS3 / 4A.

Secara umum, tanin mempunyai keupayaan untuk menggabungkan dengan ion logam dan mensasarkan protein makromolekul dan polysaccharides ³⁴. Oleh itu, adalah mungkin bahawa sebatian ini berinteraksi dengan molekul zink yang terdapat di rantau inti enzim dan dengan itu menghalang aktivitinya. Selain itu, kajian berasaskan struktur kami juga membuktikan pengikat istimewa PLN, PGN dan EA kepada triad pemangkin dan substrat mengikat laman enzim NS3protease. Ia juga dibuktikan oleh salah satu daripada laporan terdahulu yang menunjukkan bahawa sisa galloyl daripada cincin glucopyranose polifenol berinteraksi dengan Ser139, Gly137, Ala157, dan Asp81 daripada protease NS3 / 4A oleh interaksi ikatan hidrogen dan dengan Ala156 dan His57 oleh interaksi hidrofobik ³⁵. Kehadiran residu galloyl dalam punicalagin dan punicalin memberikan sokongan tambahan untuk aktiviti menghalang molekul-molekul ini terhadap protease NS3 / 4A. Selain itu, tiada kesan penghambatan sebatian ini pada aktiviti protease serine sel (trypsin) hingga kepekatan yang diuji dalam kajian kami, mungkin mencadangkan penggunaan selamat sebatian ini tanpa menjejaskan fungsi sel tuan rumah biasa.

Walaupun, kajian kami jelas menyokong sifat-sifat antiviral PGN, PLN dan EA yang diasingkan dari ekstrak kulit buah delima terhadap replikasi RNA HCV, mekanisme rumit sifat-sifat antiviral ini masih dapat dijelaskan. Perencatan protease NS3 oleh PGN, PLN dan EA (seperti yang diterangkan di atas) mungkin memberi kesan kepada pemprosesan proteolitik poliprotein HCV dan membawa kepada tahap pengurangan polimerase RNA yang bergantung kepada RNA virus yang aktif, dengan itu menindas tahap RNA HCV. Selain daripada kemungkinan ini, terdapat beberapa bukti berdasarkan sifat-sifat umum sebatian ini dari kajian terdahulu yang menghubungkan dengan peranan mekanistik mereka yang mungkin dalam menghalang aktiviti enzim virus dan replikasi. Infeksi HCV mengaktifkan ungkapan cyclooxgenase-2 (COX-2). Peningkatan pengeluaran COX-2 menyumbang kepada replikasi RNA HCV³⁶. COX-2 menginduksi HCC  dengan mengaktifkan laluan isyarat-AKT PI3-kinase-AK ³⁷, yang secara langsung dikaitkan dengan mekanisme pengawalan apoptotik dalam jangkitan akut, survival dan transformasi virus jangka panjang ³⁸. Walau bagaimanapun, ia terbukti dari kajian sebelumnya bahawa prinsip ellagitannins buah P. granatum secara sengaja menghalang aktiviti COX-2 39 dan dengan itu boleh memberi kesan anti-radang. Phospholipase cytosolic A2 (PLA2) adalah faktor utama yang diperlukan untuk replikasi HCV, pemasangan dan pengeluaran zarah HCV berjangkit. Ekstrak buah delima  dan juzuk polifenol bertindak secara sinergistik terhadap percambahan, potensi metastatik dan ekspresi PLA2 dalam sel-sel sel kanser manusia dalam-vitro 40. Selanjutnya, EA menggerakkan apoptosis dalam sel sel kanser prostat melalui pengurangan protein protein anti-apoptosis seperti HO-1 (Heme oxygenase-1), HuR (Manusia antigen R) dan SIRT1 (pengatur maklumat senyap). Ia juga mengurangkan penanda apoptotik TGF-β (mengubah faktor pertumbuhan-beta) dan IL-6 (interleukin-6) dalam bar sel kanser prostat ⁴¹. EA juga mendorong apoptosis dalam sel-sel kanser pankreas melalui menghalang NF-κB dan menyebabkan pengaktifan depolarization mitokondria ⁴². Selain itu, EA mempamerkan tindakan anti-karsinogenik melalui modulasi gen yang dikawal tekanan oksidatif ⁴³. Menariknya, kedua-dua PLN dan PGN mengandungi teras asid ellagic dan mungkin melakukan fungsi yang sama seperti EA dan menyumbang kepada perencatan hepatocarcinogenesis yang diakibatkan HCV.

Analisis farmakokinetik kami dan histoarkitektur biasa hati dan limpa dalam kedua-dua kajian ketoksikan akut dan sub akut juga mencadangkan keselamatan sebatian ini untuk ujian pramatlin kerana kekurangan ketoksikan. Untuk menyokong kajian kami, laporan terdahulu berdasarkan bioavailabiliti dan metabolisme PGN dalam tikus menunjukkan pengesanan 3-6% daripada punicalagin yang ditelan sebagai metabolit dalam plasma, air kencing dan najis ⁴⁴. Lebih-lebih lagi, pentadbiran PGN yang berulang kali didemonstrasikan sebagai nontoxic kepada tikus ⁴⁵.

Diambil bersama-sama keputusan ini menimbulkan harapan baru bahawa sebahagian besar sifat hepatoprotective buah P. granatum dan ellagitannins prinsipnya dapat dieksploitasi secara kolektif untuk menghalang kitaran hidup HCV pada tahap yang berbeza.

Kaedah
Pengumpulan dan pengekstrakan buah-buahan Punica granatum
Buah-buahan segar P. granatum dikumpulkan dari pasaran tempatan, dibasuh dengan teliti, dan kulit buah dipisahkan dari aril. Kulit kering yang dikeringkan diekstrak dengan metanol (MeOH, 90%) di bawah kondensor refluks. Aril yang mengandungi benih dipenggal di MeOH. Tambahan pula, ekstrak ini tertumpu oleh penyejat berputar (IKA, Jerman).

Pengasingan prinsip-prinsip bioaktif melalui kaedah panduan bioassay
Untuk mengenal pasti komponen aktif buah granatum P., kami menggunakan strategi yang digambarkan dalam Supplementary Fig. 2A. Pecahan sisa (residu 3) ekstrak kulit buah mentah selanjutnya dikecilkan oleh kromatografi ruang pengecualian saiz menggunakan sephadex LH-20 (Sigma Aldrich, Amerika Syarikat). Sebatian utama PLN, PGN dan EA dipadamkan secara berturut-turut dan dikenal pasti oleh LC-ESI-MS (HPLC: Thermo Finnigan Surveyor: MS: Thermo LCQ Deca XP MAX; Perisian: Xcalibur). Pencirian dan pengesahan identiti mereka selanjutnya dilakukan oleh NMR (spektrometer AV III NMR pada 400 MHz dan 100 MHz), analisis spektrum UV dan IR.

Membina plasmid
Pengenalpastian protein fusion yang mengandungi laman web cleavage NS3 / 4A di tengah-tengah diapit oleh protein fluorescent hijau dan domain selulosa yang mengikat plasmids, pYB-43 (rantai tunggal NS3 / NS4A) dan pYB-44 (EGFP-NS5A / yang diperolehi dari Dr. Itai Benhar, Universiti Tel Aviv. Pembinaan HCV JFH1 46 dan H77s ⁴⁷  cDNA adalah hadiah yang baik dari Dr. Takaji Wakita, Institut Penyakit Berjangkit Kebangsaan, Tokyo dan Dr. Stanley Lemon, University of North Carolina masing-masing.

Kultur sel
Talian sel Huh7 yang menampung replika monocistronik HCV genotip 2a ²⁹  diterima daripada Dr. Ralf Bartenschlager, Universiti Heidelberg. Huh7.5 sel sel telah diterima daripada Dr. Charles M. Rice, Universiti Rockefeller. Semua sel telah dibiakkan dalam medium Eagle Modified (DMEM; Sigma-Aldrich) Dulbecco ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin janin (Gibco), 100 U / mL penisilin (HiMedia), dan 100 μg / mL streptomycin sulphate (HiMedia ) dan dikekalkan dalam keadaan 5% CO2 dan 37 ° C. Untuk penyelenggaraan semula replika 2a yang melindungi garis sel Huh7, hygromycin B (25 μg / mL) digunakan sebagai suplemen tambahan.

Sebatian yang digunakan untuk kajian biologi
Semua sebatian ujian sama ada makmal yang disucikan atau dibeli dari sumber komersil (Natural Remedies, Bangalore, India). Telaprevir (inhibitor protease standard yang diluluskan oleh Pentadbiran Makanan dan Dadah AS) telah dibeli dari MedChem Express, Amerika Syarikat.

Penyediaan sampel ujian untuk kajian kultur in vitro dan sel
Sebatian semulajadi serta telaprevir disimpan pada kepekatan 10 mM dalam 100% dimetil sulfoksida (DMSO). Sedangkan ekstrak metanol kering dari kulit P. granatum dan ekstrak jus dan pecahan yang berbeza (pecahan 1-3) serta residu-3 disediakan dalam kepekatan 1 mg / 10 μL (w / v).

Assay protease NS3
Untuk mengkaji kesan sebatian PGN, PLN, EA dan ekstrak mentah pada aktiviti protease HCV NS3 / 4A, ujian fluorimetrik dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya ⁴⁸. Secara ringkas, rantaian tunggal protease NS3 (0.1 μM) telah diinkubasi dengan peningkatan kepekatan sampel ujian diikuti dengan penambahan protein substrat gabungan yang disucikan (EGFP-NS5A / B-CBD, 0.5 μM) dan diinkubasi selama satu jam lagi pada 37 ° C. Reaksi itu ditamatkan dan intensiti isyarat pendarfluor yang berubah dari substrat EGFP yang dicelupkan oleh fluorometer (Modulus ™ Microplate Multimode Reader) menggunakan penapis pengujaan 485 nm dan penapis pelepasan 538 nm.

Susu protease trifsin selular
Ujian protease selular mudah sensitif (trypsin) dilakukan secara in vitro menggunakan alat pengesan pendarfluor protease (Sigma-Aldrich) mengikut arahan pengeluar. Pengujian ini mengesan aktiviti protease menggunakan kasein yang dilabelkan dengan substrat fluorescinisothiocynate (FITC ) ⁴⁹.

Analisis berasaskan pengetahuan struktur dan docking molekul
Ligand yang serupa dengan PLN, PGN dan EA telah dicari dalam PDB ⁵⁰, dalam struktur protein ligand-terikat, menggunakan ligand ⁵¹. Kesamaan ligand ditaksir dengan membandingkan rentetan SMILE mereka (SMILES string: Sistem kemasukan input molekul mudah dipermudahkan: Notasi garis yang menggambarkan struktur molekul kimia). Ligands terikat kepada pelbagai struktur protein yang sama dengan ligan yang menarik dianalisis untuk cara perencatan, sifat interaksi menggunakan pelayan interaksi protein-ligand, LPC CSU ⁵²  dan pemangkin atlas ⁵³.  Oleh kerana struktur EA menyerupai sub-struktur PLN dan PGN, analisis berasaskan pengetahuan telah diekstrapolasi untuk EA. Oleh itu, analisis ini membantu dalam memilih secara lekatkan ligan-ligan kepentingan di kawasan-kawasan kritikal seperti rantau pemangkin dan rantau pengikat substasi NS3 protease (PDB id: 1dy³²-aktif HCV Serine protease yang digabungkan dengan NS4A co faktor). Struktur 3D ligan sebatian diperoleh daripada pangkalan TCM (Perubatan Tradisional Cina) 54. Docking protin-protein telah dijalankan menggunakan Autodock 4.2⁵⁵. Model peringkat terbaik dengan tenaga mengikat yang rendah dianalisis lagi dan digambarkan menggunakan PyMOL (Versi Pygol Molecular Graphics Version 1.5.0.4) ⁵⁶. Struktur Telaprevir digunakan untuk berlabuh ke struktur NS3 dan protokol dok yang sama diikuti seperti yang diterangkan sebelumnya.

Ujian antiviral untuk sistem kebudayaan sel replika subgenomik
Sel Huh7 yang memelihara replika HCV telah dirawat dengan peningkatan kepekatan sebatian ujian, PGN, PLN dan EA (10-150 μM) dan selanjutnya diinkubasi selama 48 jam. Sel dituai dalam reagen TRIzol (Sigma-Aldrich). Jumlah RNA selular telah diekstrak diikuti oleh transkripsi terbalik menggunakan HCV primer ke hadapan (untuk menangkap benang negatif HCV) sepadan dengan rantau IRES (5′-TGCGGAACCGGTGAGTACA-3 ‘). CDNA yang diperoleh bercampur dengan SYBR Green PCR Master Mix dan tertakluk kepada PCR kuantitatif. GAPDH digunakan sebagai kawalan endogen untuk menormalkan hasil.

Ujian antiretroviral JFH-1
HCV JFH-1 zarah virus berjangkit dihasilkan seperti yang dijelaskan sebelumnya ⁴⁶. Huh 7.5 sel-sel telah dijangkiti virus JFH1 dengan ketiadaan atau kehadiran sebatian ujian yang berbeza, PGN, PLN dan EA pada 150 μM, diikuti dengan penuaian sel pada 72 jam selepas rawatan. Jumlah RNA selular telah diekstrak dan tertakluk kepada RT-qPCR.

H77S berasaskan ujian replikasi
Konstruk H77s-cDNA adalah linearized dan H77s RNA disintesis oleh transkripsi run-off. Huh 7.5 sel telah ditransmisikan dengan RNA H77s berjangkit menggunakan lipofectamine 2000. Empat jam kemudian, sel-sel telah dirawat dengan sebatian ujian. Pada 48 jam selepas rawatan, sel-sel dikumpulkan untuk pengasingan RNA selular yang diikuti oleh RT-qPCR.

HCV penyertaan masuk dalam ujian
Huh7.5 sel telah dibangkitkan dalam 6 pinggan dengan kiraan sel 0.3 × 106. Pada hari berikutnya, sel-sel telah diberi preparasi pada 4 ° C selama 1 h diikuti dengan jangkitan dengan virus HCV-JFH1 pada 4 ° C selama 2 jam untuk membolehkan zarah virus untuk melampirkan dengan reseptor permukaan sel. Ini diikuti dengan rawatan sel dan kompleks virus dengan sebatian dan beralih kepada 37 ° C selama 3 jam lagi. Peralihan ini membolehkan virus memasuki sel. Pada 72 jam rawatan selepas jumlah RNA selular diekstrak dan tertakluk kepada RT-qPCR.

Ujian Cytotoxicity
Kesan sitotoksik sebatian ujian yang berbeza dalam budaya sel ditentukan oleh ujian MTT seperti yang dijelaskan sebelumnya ⁵⁷.

Pelepasan beretika untuk kajian vivo
Eksperimen haiwan telah diluluskan oleh ‘Jawatankuasa Institusi Etika Haiwan’. Tikus BALB / c (6 hingga 8 minggu) dipilih dari koloni inbred dan dikekalkan di bawah keadaan terkawal standard. Haiwan-haiwan ini disediakan dengan makanan dan air libitum adunan.
Penyediaan ubat untuk kajian vivo
Kepekatan CE, PLN, PGN dan EA yang diperlukan di dalam air suling steril (SDW). Hanya SDW tanpa sebatian digunakan sebagai kawalan kenderaan dalam semua percubaan vivo.
Penentuan ketoksikan oral akut

Untuk penilaian keselamatan, ketoksikan akut CE buah delima  dan prinsip bioaktifnya, PGN, PLN dan EA ditentukan mengikut garis panduan Organisasi dan Pembangunan Ekonomi (OECD 423)⁵⁸. Tikus betina BALB / c telah berpuasa selama empat jam. Dos akut (2000 dan 5000 mg / kg berat badan b.wt.) ekstrak dan sebatian diberikan secara lisan. Haiwan diberi makanan dan air selepas 2 jam pentadbiran ubat dan terus dipantau untuk tanda-tanda toksik. Berat badan dan kematian direkodkan secara tetap sehingga 14 hari. Pada hari ke-14, semua tikus dari kumpulan kawalan dan rawatan telah dikorbankan dan histopatologi hati dan tisu limpa disiasat menggunakan kesan haematoxylin dan eosin (Bioneeds India Pvt Ltd, Bangalore).

Penentuan ketoksikan sub-akut
Ketoksikan subakut ditentukan mengikut garis panduan OECD 407⁵⁹. Tikus BALB / c yang sihat dibahagikan kepada 4 kumpulan 3 tikus. Satu dos 1000 mg / kg b.wt / tikus / hari PGN, PLN, atau EA diberikan secara berterusan selama 28 hari untuk setiap kumpulan secara berasingan. Semasa tingkah laku am rawatan, pengambilan makanan dan air, tanda-tanda kelainan dan kematian telah dirakam secara kritikal. Berat badan setiap tikus dalam kumpulan yang berbeza diambil setiap hari alternatif. Pada hari ke-29, semua tikus telah dikorbankan. Hati dan limpa ditimbang dan tertakluk kepada analisis histopatologi.

Penilaian bioavailabiliti dalam tikus BALB / c
Di sini, sejumlah 48 tikus telah diambil dan dibahagikan kepada tiga kumpulan 16 tikus masing-masing. Satu dos (1000 mg / kg b.wt per tikus) PGN, PLN dan EA diberikan secara oral kepada setiap kumpulan secara berasingan. Sampel darah dikumpulkan pada titik masa yang berlainan (0-24 jam). Plasma dikumpulkan dan dianalisis untuk ubat atau metabolit yang ditadbir oleh kaedah analisis seperti yang dinyatakan sebelum ini (ref. ⁶⁰) dengan sedikit pengubahsuaian. Kurva kalibrasi standard EA (metabolit aktif PGN dan PLN) telah diambil dengan menggunakan persamaan regresi linear. Kawasan di bawah kurva (AUC) telah diplot, dan kepekatan dan maksimum waktu setiap kompaun telah dikira.

Kajian dijalankan oleh: