Al Manna – Gum Arab Mengurangkan Protein C-Reaktif dalam Pesakit Penyakit Buah Pinggang Kronik CKD

Satu kajian oleh saintis dari King Fahad Specialist Hospital Arab Saudi keatas 36 orang pesakit  telah mendapati penggunaan Al Manna atau gam arab berjaya menurunkan kadar Protin C-Reaktif pesakit yang mengidap penyakit buah pinggang kronik atau CKD. Lihat kajian penuh saintis berkenaan di bawah.

Kajian oleh:

ABSTRAK:

Pengenalan

Al Manna – Gum Arabic (GA) adalah polysaccharide kompleks dengan sifat prebiotik yang terbukti dan kesan sistemik yang berpotensi serta bermanfaat.

Kaedah

36 pesakit penyakit buah pinggang kronik (CKD) menyertai kajian kami dan mereka dipilih secara rawak untuk menerima 10, 20 atau 40 gram setiap hari Al Manna – Gum Arabic (GA) selama empat minggu dan mengkaji kesan sistemik intervensi ini.

Keputusan

Tiga puluh peserta menyelesaikan kajian dengan kadar penapisan glomerular baseline 29.1 ± 9.9 mL / min / 1.7 m2. Berbeza dengan pemerhatian terdahulu, kami mendapati tiada kesan pada kadar serum urea atau kreatinin. Suplemen Al Manna – Gum Arabic (GA)  dikaitkan dengan penurunan natrium serum yang kecil tetapi statistik secara ketara (138 ± 2 hingga 136 ± 3 mmol / L, p = 0.002) tanpa menjejaskan tahap elektrolit, isipadu air kencing, atau tahap indoksil sulfat (IS). Suplemen Al Manna – Gum Arabic (GA)  juga dikaitkan dengan penurunan ketara kadar protein C-reaktif (CRP) (3.5 ± 1.5 hingga 2.8 ± 1.6 ng / mL, p = 0.02) walaupun pada pesakit yang menerima hanya 10 g / hari (4.4 ± 1.2 hingga 3.2 ± 1.5 ng / mL, p = 0.03).

Kesimpulan dari kajian ini menunjukkan bahawa dengan meningkatkan pemakanan pesakit CKD dengan 10-40 g / hari Al Manna – Gum Arabic (GA)  berjaya menurunkan tahap CRP yang dapat memberi kesan positif terhadap morbiditi dan mortaliti pesakit. Percubaan ini didaftarkan dengan Nombor Pendaftaran Percubaan Klinikal Saudi 15011402.

————————————————————————————————————————

1. Pengenalan

Pesakit buah pinggang penyakit kronik (CKD) mengalami keadaan keradangan kronik yang berterusan dan saluran gastrousus adalah penyebab yang berpotensi untuk keradangan ini. Uremia dikaitkan dengan banyak pertambahan bakteria dalam duodenum dan jejunum, prevalens bakteria patogenik yang lebih tinggi dalam najis, dan gangguan fungsi penghalang usus [1]

Alasan di sebalik gangguan mikrobiom usus ini adalah pelbagai. Kepekatan urea yang tinggi meresap ke kolon dan memberikan substrat yang kaya untuk peningkatan mikrob. Penyimpalan protein terjejas dalam usus kecil membolehkan sejumlah besar protein mencapai kolon, secara selektif menggalakkan pertumbuhan bakterol proteolitik. Sembelit membolehkan lebih banyak masa untuk penapaian asid amino berlaku di kolon dan seterusnya menggalakkan pertumbuhan bakteria patogen [1]

Hasil sampingan daripada penapaian asid amino meresap dari kolon ke dalam sistem peredaran. Kerana pelepasan buah pinggang berkurangan, paras mereka memperlihatkan kenaikan eksponen yang tinggi pada pesakit buah pinggang. Para penyelidik telah memberi tumpuan kepada dua molekul retensi uremik tersebut; indoksil sulfat (IS) dan p-cresyl sulfate (PCS)  [2]. Kedua-dua toksin ini telah dikaitkan dengan kemerosotan fungsi buah pinggang, penyakit kardiovaskular, dan kematian keseluruhan dalam populasi CKD [3, 4].

Oleh itu, mikrobaom usus adalah sasaran yang berpotensi berguna untuk intervensi terapeutik dalam pesakit CKD. 20 tahun lalu, Bliss et al.  [5] menunjukkan bahawa diet pemulihan pesakit CKD dengan serat yang sangat tinggi (50 g / hari) meningkatkan massa bakteria fecal sebanyak 50%, meningkatkan kandungan nitrogen fecal sebanyak 41%, dan mengurangkan kepekatan urea nitrogen (BUN) darah sebanyak 12% . Baru-baru ini, menganalisis data dari Kajian Kesihatan dan Pemakanan Peperiksaan Kebangsaan III menunjukkan bahawa pengambilan serat yang tinggi secara terbalik dikaitkan dengan tahap protein C-reaktif (CRP) dan mortaliti dalam peserta kajian yang mengidap penyakit buah pinggang [6]. Ini menyebabkan kebangkitan minat penyelidik terhadap manipulasi diet pesakit CKD.

Al Manna – Gum Arabic (GA) adalah polysaccharide kompleks yang berasal dari tumbuhan semulajadi [7]. Ia adalah serat pemakanan yang sangat boleh dipercayai dengan ciri-ciri prebiotik yang terbukti  [8]. Disamping kajian yang telah disebutkan sebelumnya oleh Bliss et al., Terdapat laporan lain para ahli nefrologis menggunakannya dalam keadaan kos yang rendah untuk meringankan gejala uremik dan mengurangkan keperluan untuk dialisis [9, 10]. Ia juga biasa digunakan dalam perubatan rakyat sebagai ubat untuk penyakit buah pinggang.

Tujuan kajian ini adalah untuk menilai kesan sistemik jangka pendek penambahan GA dalam pesakit CKD. Dengan mempromosikan pembiakan bakteria saccharolytic di usus besar, kami menjangkakan Al Manna – Gum Arabic (GA)  dapat menahan bakteria patogen dan mengurangkan tahap metabolit toksik mereka dalam darah. Hasilnya, kami menjangkakan penambahan Al Manna – Gum Arabic (GA)  untuk meningkatkan penanda radang pada pesakit CKD.

2. Kaedah

Ini adalah percubaan klinikal rawak terbuka dengan reka bentuk selari. Objektif kami adalah untuk menentukan kesan tiga dos berbeza Al Manna – Gum Arabic (GA)  pada urea, molekul pengekalan uremik, dan keradangan pada pesakit CKD. Kami menganggarkan bahawa 10 pesakit setiap kumpulan akan memberi kesan 80% kajian untuk mengesan perbezaan yang sama dengan satu sisihan piawai yang penting dalam parameter kajian pada tahap 0.05.

Kami merekrut pesakit dari klinik nefrologi di Hospital Pakar King Fahad di Dammam, Arab Saudi. Pelepasan etika diperolehi dari lembaga semakan institusi dan semua pserta kajian menandatangani borang persetujuan bertulis sebelum penyertaan. Calon yang layak adalah pesakit CKD dewasa di peringkat 3B / 4. Anggaran kadar penapisan glomerular (eGFR) dikira dengan menggunakan empat formula MDRD berubah. Kami mengecualikan pesakit dengan keganasan, penyakit hati, reseksi usus, penyakit radang usus, terapi antibiotik baru-baru ini, atau kegunaan GA baru-baru ini.

Menurut syarat pengambilan, kami membahagikan pesakit kepada tiga kumpulan yang sama menggunakan senarai nombor rawak yang dijana oleh komputer. Kami memberi setiap setiap pesakit  28 paket yang mengandungi 10, 20, atau 40 gram Al Manna – Gum Arabic (GA)  dalam bentuk granul langsung larut (Agri-Rapid Acacia RE, Agrigum, UK). Kami meminta pesakit untuk melarutkan kandungan setiap pakej dalam segelas air atau jus dan minum setiap hari selama empat minggu.

Dua set data dikumpulkan, sebelum dan selepas kajian. Ini termasuk temubual klinikal untuk mendokumenkan keterukan gejala gastrointestinal, sampel darah, dan koleksi air kencing sepanjang tempoh 24 jam. Kajian makmal rutin dilakukan pada hari yang sama menggunakan penganalisis automatik. Alzheimer beku dan air kencing telah digunakan untuk mengukur penanda inflamasi dan paras IS di kemudian hari. CRP diukur menggunakan kit CRP Quantikine ELISA (R & B ™, UK). Interleukin, mengubah faktor pertumbuhan alpha (TNF-α), dan gamma interferon (IFN-γ) diukur dengan menggunakan Bio-Plex Precision Human Cytokine Assay (Biorad ™, USA). Faktor pertumbuhan pertumbuhan kencing beta (TGF-β) diukur dengan menggunakan kit TGF-β Quantikine ELISA (R & B, UK). IS diukur oleh kromatografi cecair seperti yang diterangkan oleh Lin et al. [11].

Versi SPSS 19 digunakan untuk analisis statistik. Pembolehubah berterusan dan kategoris dibandingkan dengan ujian t-pasangan dan uji homogeneiti marginal. p <0.05 dianggap signifikan secara statistik.

3. Keputusan

Tiga puluh pesakit dimasukkan ke dalam analisis akhir; Ciri-ciri asasnya dijelaskan dalam (Figure 1).

Selepas penambahan Al Manna – Gum Arabic (GA), terdapat pengurangan yang kecil tetapi statistik secara signifikan dalam kadar natrium serum (137.8 ± 2.4 hingga 136.3 ± 3.1 mmol / L, p = 0.002). Tiada perubahan dalam kreatinin, urea nitrogen darah (BUN), kalium, kalsium, magnesium, asid urik, hormon parathyroid, atau kadar hemoglobin. Tiada perubahan dalam jumlah air kencing, ekskresi urea, perkumuhan kreatinin, atau perkumuhan protein. Tahap IS juga tidak terjejas (Table 2).

Suplemen Al Manna – Gum Arabic (GA) dikaitkan dengan penurunan statistik dalam tahap CRP (3.5 ± 1.5 hingga 2.8 ± 1.6 ng / mL, p = 0.02), tetapi tidak terdapat kesan yang signifikan terhadap penanda keradangan lain, termasuk TGF-β kencing (Table 3). Penurunan tahap CRP dilihat dalam semua kumpulan pesakit dan secara statistiknya signifikan pada pesakit yang menerima hanya 10 g / hari (4.4 ± 1.2 hingga 3.2 ± 1.5 ng / mL, p = 0.03)

(Figure 2).

Open in a separate window

Figure 2

Baseline and follow-up C-reactive protein (CRP) values in different study groups. ^⋆An outlier in the data displayed by this boxplot.

Table 1

Baseline characteristics of the study population (n = 30).

Parameter	Group-1 (10 g/day)	Group-2 (20 g/day)	Group-3 (40 g/day)	p value
Number	12	9	9
Age	48 ± 12  (30–66)	52 ± 18  (18–75)	50 ± 17  (18–74)	0.8
Male/female	8/4	6/3	6/3	1.0
Diabetes mellitus	41.7%	33.3%	55.6%	0.6
CKD stage 3B/4	8/4	3/6	4/5	0.3
eGFR (mL/min/1.7 m2)	26 ± 10	33 ± 11	29 ± 9	0.3
Creatinine (µmol/L)	250 ± 92	201 ± 78	216 ± 48	0.3
BUN (mmol/L)	14 ± 6	12 ± 5	14 ± 4	0.4
Immunosuppression∗	33.3%	22.2%	22.2%	0.8

CKD: chronic kidney disease; eGFR: estimated glomerular filtration rate; BUN: blood urea nitrogen.

^∗For systemic lupus erythematosus and chronic glomerulonephritis.

Table 2

Effect of Gum Arabic supplementation on renal parameters (n = 30).

Parameter	Baseline level	Follow-up level	p value
eGFR (mL/min/1.7 m2)	29.1 ± 9.9	29.5 ± 11.1	0.5
Creatinine (µmol/L)	225 ± 77	227 ± 83	0.7
BUN (mmol/L)	13.5 ± 5.0	13.6 ± 5.3	0.8
Sodium (mmol/L)	137.8 ± 2.4  (131–143)	136.3 ± 3.1  (128–141)	0.002∗
Potassium (mmol/L)	4.5 ± 0.5	4.6 ± 0.6	0.3
Bicarbonate (mmol/L)	24.0 ± 3.7	24.2 ± 3.2	0.8
Uric acid (mmol/L)	466 ± 98	453 ± 96	0.3
Calcium (mmol/L)	2.4 ± 0.1	2.4 ± 0.1	0.1
Phosphorus (mmol/L)	1.2 ± 0.2	1.3 ± 0.2	0.8
Magnesium (mmol/L)	0.8 ± 0.2	0.8 ± 0.1	0.9
Parathyroid hormone (pg/mL)	256 ± 334	256 ± 316	1.0
Hemoglobin (g/dL)	12.1 ± 2.5	12.1 ± 2.3	0.8
Indoxyl sulfate (mg/L)	1.2 ± 2.9	1.2 ± 2.4	0.9
Urine volume (mL/day)	2116 ± 704	2167 ± 692	0.6
Creatinine excretion (g/day)	1.1 ± 0.4	1.1 ± 0.4	0.6
Urea excretion (mmol/day)	268 ± 88	275 ± 89	0.7
Protein excretion (g/day)	3.2 ± 4.1	3.4 ± 4.8	0.6
Creatinine clearance (mL/day)	33.4 ± 14.4	34.8 ± 17.4	0.4
Urea clearance (mL/day)	15.6 ± 7.7	16.3 ± 8.5	0.4

Open in a separate window

eGFR: estimated glomerular filtration rate; BUN: blood urea nitrogen.

^∗Statistically significant.

Table 3

Effect of Gum Arabic dietary supplementation on mean values of various inflammatory markers in studied chronic kidney disease patients (n = 30).

Parameter	Baseline	Follow-up	p value
Serum CRP (ng/mL)	3.5 ± 1.5	2.8 ± 1.6	0.02∗
Serum IL-1 (pg/mL)	0.39 ± 0.38	0.35 ± 0.41	0.7
Serum IL-2 (pg/mL)	26.0 ± 128	17.2 ± 82	0.3
Serum IL-4 (pg/mL)	0.24 ± 0.15	1.37 ± 6.1	0.3
Serum IL-5 (pg/mL)	36.9 ± 137	15.5 ± 45.5	0.2
Serum IL-6 (pg/mL)	29.9 ± 80.1	20.9 ± 47.9	0.5
Serum IL-10 (pg/mL)	3.9 ± 2.9	3.3 ± 2.9	0.3
Serum IL-12 (pg/mL)	1.0 ± 3.7	0.5 ± 1.4	0.3
Serum IL-13 (pg/mL)	0.4 ± 0.4	0.3 ± 0.4	0.3
Serum IFN-γ (pg/mL)	0.93 ± 0.93	2.1 ± 7.6	0.4
Serum TNF-α (pg/mL)	0.58 ± 0.6	0.37 ± 0.5	0.2
Urinary TGF-β (pg/mL)	14.8 ± 16.3	17.7 ± 19.9	0.4

CRP: C-reactive protein; IL: interleukin; IFN: interferon; TNF: tumor necrosis factor; TGF: transforming growth factor.

^∗Statistically significant.

Al Manna – Gum Arabic (GA) supplements were well tolerated with no significant gastrointestinal side effects (Table 4). One patient discontinued the supplements after one dose because she did not like the texture of the solution. One patient returned 14 doses, three patients returned three doses, two patients returned two doses, five patients returned one dose, and nineteen patients returned no doses. Overall, 93% of dispensed doses were consumed.

Table 4

The severity of gastrointestinal symptoms at baseline and at follow-up among studied chronic kidney disease patients (n = 30).

Symptom	Baseline (%)			Follow-up (%)			p value
	None	Mild	Severe	None	Mild	Severe
Abdominal pain	70	30	0	73.3	23.3	3.3	1
Abdominal distention	60	40	0	73.3	23.3	3.3	0.2
Flatulence	60	36.7	3.3	53.3	26.7	20	0.1
Nausea	93.3	6.7	0	93.3	6.7	0	1
Diarrhea	90	10	0	93.3	6.7	0	0.7
Constipation	63.3	26.7	10	73.3	23.3	3.3	0.3

Makanan tambahan Al Manna – Gum Arabic (GA)  diterima dengan baik tanpa kesan sampingan gastrousus  (Table 4). Satu pesakit berhenti suplemen selepas satu dos kerana dia tidak suka teksturnya. Satu pesakit kembali 14 dos, tiga pesakit kembali tiga dos, dua pesakit kembali dua dos, lima pesakit kembali satu dos, dan sembilan belas pesakit tidak kembali dos. Secara keseluruhan, 93% dos yang dibekalkan digunakan.

4. Perbincangan

Serat diet adalah kumpulan heterogen dengan sifat fisiokimia berubah-ubah yang ditentukan oleh komposisi fizikal dan kimia gentian. Tindakan fisiologi serat pemakanan tertentu ditentukan oleh sifat-sifat tersebut, termasuk kerentanan penapaian bakteria, kapasiti penahan air, pertukaran kation, dan fungsi adsorpsi [12]. Ini menjelaskan tindak balas fisiologi yang berbeza yang diperolehi selepas suplemen makanan dengan gentian yang berbeza.

Semasa kajian in vitro, Al Manna – Gum Arabic (GA)  menunjukkan penghasilan asid lemak rantaian pendek (SCFA) dan kehilangan bahan organik melalui penapaian (69.5%) berbanding dengan serat soya (56.4%), serat hull oat, carboxymethyl-cellulose, dan psyllium 20%) [13]. Dalam eksperimen lain, Al Manna – Gum Arabic (GA)  menghasilkan kesan prebiotik yang lebih besar daripada dos inulin bersamaan dan mempunyai toleransi yang sangat baik [8]. Hasil dati keputusan kajian ini, kami mengesyorkan Al Manna – Gum Arabic (GA)  sebagai suplemen serat pemakanan optimum bagi pesakit dengan CKD.

Berbeza dengan pemerhatian sebelumnya, makanan tambahan Al Manna – Gum Arabic (GA) tidak memberi kesan pada tahap BUN dalam kajian ini. Tahap pertama produk sisa nitrogen dan pematuhan ketat kepada diet protein yang rendah mungkin diperlukan untuk suplemen serat makanan untuk mempunyai kesan yang ketara pada tahap BUN. Dalam percubaan yang telah disebutkan sebelumnya oleh Bliss et al. [5], pesakit mempunyai masaalah buah pinggang dengan tahap creatinine awal 390 ± 70 μmol / L berbanding 225 ± 77 μmol / L. Laporan sebelumnya Al Manna – Gum Arabic (GA) mengurangkan tahap BUN dan kreatinin juga diperolehi daripada pesakit yang mengalami kekurangan buah pinggang atau pergantungan dialisis [9, 10]. Bagi serat makanan lain, menambah diet pesakit CKD dengan arabinoxylan oligosaccharide (20 g / hari) atau kacang hull (10 g / hari) dan inulin (15 g / hari) juga gagal mengurangkan tahap BUN [14, 15]. Meningkatkan diet pesakit HD dengan kanji jagung tinggi amilosa (15 g / hari) tidak mempunyai kesan ke paras BUN [16] manakala inulin diperkayakan oligofruktosa (20 g / hari) merendahkan tahap urea dari 126 hingga 119 mg / dL  [17].

Begitu juga, tahap IS tidak terjejas oleh penambahan Al Manna – Gum Arabic (GA) dalam percubaan ini. Ini dapat dijelaskan oleh tahap asas yang agak rendah yang menunjukkan pelepasan buah pinggang yang lebih cekap. Dalam kajian yang dirancang untuk menunjukkan kesan penyerap oral pada peringkat IS, penyelidik memilih pesakit dengan pelepasan creatinine asas kurang daripada 20 mL / min dan tahap IS asas lebih besar daripada 5 mg / L [18]. Dalam kajian semasa, hanya dua pesakit yang mengalami kekurangan buah pinggang yang terperinci mempunyai paras IS yang tinggi pada tahap awal dan kedua-dua peringkat menurun selepas campur tangan kajian (12.5 hingga 11.2 dan 10.6 hingga 7.8 mg / L). Mengukur kadar perkumuhan kencing selama 24 jam mungkin mencerminkan magnitud pengeluaran IS oleh bakteria kolon lebih tepat berbanding tahap serum, terutama pada pesakit yang mengalami kekurangan buah pinggang yang sederhana. Malangnya, kami tidak dapat melakukan pengukuran ini dalam kajian semasa.

Bagi serat makanan lain, menambah diet pesakit CKD dengan arabinoxylan oligosaccharide (20 g / hari) juga tidak mempunyai kesan ke paras serum atau kadar perkumuhan urin 24 jam IS sementara menambah diet pesakit HD dengan kanji jagung tinggi amilosa (15 g / hari) mengurangkan tahap IS percuma [14, 15].

Dalam percubaan ini, penambahan Al Manna – Gum Arabic (GA) kepada pesakit CKD dikaitkan dengan pengurangan ketara dalam tahap CRP. Kesan ini terbukti dalam pesakit yang menerima hanya 10 g / hari Al Manna – Gum Arabic (GA), menyokong pemerhatian sebelumnya bahawa 10g / hari Al Manna – Gum Arabic (GA)  menyediakan kesan prebiotik yang optimum [8]. Setakat yang kita tahu, ini adalah percubaan pertama untuk menunjukkan bahawa suplemen serat makanan boleh mengurangkan penanda radang pada pesakit CKD predialisis. Ujian sebelumnya suplemen serat pemakanan untuk pesakit CKD predialisis didapati tidak memberi kesan ke atas tahap CRP, termasuk ujian yang menggunakan ariginoxylan oligosakarida dan gabungan pea hull dan inulin [14, 16]. Begitu juga keputusan negatif diperolehi selepas menambah diet pesakit HD dengan kanji jagung tinggi-amilosa atau inulin diperkayakan oligofructose [15, 17]. Satu-satunya percubaan yang menemui kesan positif suplemen serat makanan pada tahap CRP telah dijalankan pada sekumpulan pesakit HD yang menggunakan 10-20 g / hari serat pemakanan yang sangat boleh dimakan (jenis tidak dinyatakan). Penulis melaporkan dengan ketara mengurangkan CRP (10.7 ± 4.8 hingga 4.8 ± 4.5 mg / L, p <0.05), IL-6, dan tahap TNF-α selepas suplemen serat makanan [19].

Kerana sifat penjagaan tertiari hospital kita, ramai pesakit yang menjalani pemeriksaan rutin di klinik nefrologi dikecualikan daripada percubaan ini kerana malignancy atau penyakit hati. Pesakit lain merosot kerana mereka bergantung kepada ahli keluarga untuk pengangkutan dan ingin mengelakkan lawatan tambahan ke hospital. Ini mengehadkan jumlah peserta. Oleh itu, kami tidak dapat memasukkan kumpulan kawalan dan terpaksa bergantung kepada ujian t berpasangan untuk mengesahkan kepentingan statistik pengamatan kami. Di samping itu, kami tidak dapat melakukan kiraan najis bakteria atau mengukur kadar perkumuhan kencing 24 jam IS sebagai penunjuk tidak langsung bakteria penapaian protein dalam kolon.

Walaupun terdapat batasan-batasan ini, kami dapat menunjukkan untuk pertama kalinya bahawa suplemen malignancy mengurangkan penanda radang pada pesakit CKD predialisis. CRP boleh menjadi penanda tidak spesifik keradangan, tetapi ia telah ditunjukkan dalam kajian epidemiologi untuk terbalik secara terus-menerus dengan kematian pada pesakit CKD [6]. Pada pendapat kami, percubaan ini meletakkan asas untuk percubaan klinikal yang besar, rawak, dan terkawal untuk menentukan kesan jangka panjang penambahan malignancy pada kematian dan kemajuan penyakit CKD.

6. Kesimpulan

Meningkatkan pemakanan pesakit CKD dengan 10-40 g / hari Al Manna – Gum Arabic (GA) tidak memberi kesan ke atas paras BUN dan IS. Walau bagaimanapun, suplemen Al Manna – Gum Arabic (GA) dikaitkan dengan pengurangan ketara dalam tahap CRP. Ini boleh memberi kesan positif terhadap morbiditi dan mortaliti jangka panjang pengidap pesakit ini.

Penghargaan

Percubaan klinikal ini dibiayai oleh geran yang diberikan oleh King Abdul-Aziz City untuk Sains dan Teknologi (KACST) di Arab Saudi (nombor 35-300). Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Profesor Yacine Badjah dan Pengerusi Penyelidikan Bahan Lanjutan di Universiti King Saud di Riyadh untuk bantuan mereka dalam melaksanakan ujian kromatografi cair.

Konflik Kepentingan

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Artikel asal: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446885/