Aktiviti Virus Anti-Influenza Ekstrak Kulit Buah Delima (Punica granatum L.)

Buah Delima (Punica granatum L) adalah salah satu daripada buah-buahan yang boleh dimakan yang paling lama dan ditanam secara meluas di banyak negara tropika dan subtropika 1, termasuk Iran, Mesir, Rusia, Sepanyol, Perancis, China, Jepun, Argentina, Amerika Syarikat , dan India. Delima telah digunakan secara meluas sebagai ubat di Iran dan banyak negara lain. Banyak kajian menunjukkan kesan antioxidant, antiatherogenic, dan anti-inflamasi, antimikrob dan anti-infeksi buah delima dan ekstrak kulit buah 2–6.

Walaupun kulit buah delima kadang-kadang dianggap sebagai sisa buangan, ia sebenarnya adalah sumber flavonoid yang terbaik untuk antibakteria, antivirus, antioksidan, anti-radang dan antinoplastik bioaktiviti 7,8.

Salah satu patogen saluran pernafasan manusia yang paling biasa, yang berkaitan dengan morbiditi dan mortaliti yang tinggi, iaitu virus influenza, adalah  dianggap pencetus kebimbangan kesihatan awam. Walaupun vaksin adalah pendekatan yang sesuai untuk mencegah influenza, kaedah ini harus dikemaskini menjadi lebih  berkesan pada subtipe baru hasil dari perubahan yang berterusan dalam permukaan virus. 9.

Pada masa ini terdapat dua kumpulan agen anti-influenza yang tersedia untuk pengurusan jangkitan influenza. Kumpulan pertama termasuk amantadine dan rimantadine yang merupakan inhibitor ion-channel protein matriks (M2) dan mengganggu un-coating virus dalam sel-sel perumah. Mereka hanya berkesan terhadap virus influenza A dengan risiko rintangan dadah yang meluas. Kumpulan lain termasuk oseltamivir dan zanamivir yang merupakan perencat Neuraminidase (NA) dan digunakan secara meluas dalam rawatan kedua-dua jangkitan virus influenza bermusim dan pandemik 10. Walau bagaimanapun, strain H1N1 tahan oseltamivir didapati diedarkan sejak 2007-08 11,12. Oleh kerana pilihan untuk kawalan dan rawatan penyakit adalah terhad, penggunaan ekstrak herba seperti delima kelihatannya ada potensi yang baik sebagai alternatif. Kajian ini dijalankan untuk menilai aktiviti virus anti-influenza A ekstrak hidro alkohol dari buah delima (Punica granatum L.) dalam vitro.

Bahan dan Kaedah
Pengumpulan Bahan, pengekstrakan dan pecahan

Buah delima (Punica granatum L.) adalah dari Malas variant yang diperoleh dari Shahreza, sebuah wilayah tengah Iran (Oktober 2015). Kemudian, di Herbarium Pusat Penyelidikan Tanaman Perubatan Shahrekord University of Medical Sciences (Iran), genus dan spesies tumbuhan telah dikenal pasti dan disahkan. Serbuk delima diadun dengan 80% etanol dan disimpan pada suhu bilik selama 96 jam. Kemudian, campuran itu ditapis dan diletak di bawah tekanan vakum pada 40 ° C dalam penyejat berputar. Empat pecahan ekstrak mentah, dengan polariti yang berbeza telah disediakan oleh pengasingan larutan dan menggunakan perbezaan dalam pelbagai kutub metabolit sekunder (Figure 1). Ekstrak mentah telah diadun dalam etil alkohol / H2O dan difraksinasi oleh pembahagian cecair / cecair berturut-turut dengan n-heksana (Merck, Jerman), dan kemudian dengan chloroform (Merck, Jerman), etil asetat (Merck, Jerman) dan n-butanol Merck, Jerman) dengan peningkatan polariti 13.

Penentuan jumlah kandungan fenolik
Jumlah kandungan fenolik ekstrak kulit delima dan pecahannya ditentukan dengan menggunakan kaedah Folin-Ciocalteu 14. Asid Gallik digunakan sebagai rujukan standard untuk merancang kurva penentukuran. Secara ringkas, ekstrak / pecahan kering atau asid gallic dicampur dalam 80% metanol untuk menyediakan 1 mg / ml larutan. 0.2 ml ekstrak / pecahan yang dicairkan atau larutan standard asid gallic (250, 125, 62.5, 31.2, dan 15.6 μg / ml) ditambah Folin-Ciocalteu 1% 10% (v / v) pada suhu bilik selama 3-8 minit. Seterusnya, larutan natrium karbonat 0.8 ml 7.5% (w / v) ditambah kepada campuran. Selepas peroses tindak balas disimpan dalam kegelapan selama 30 minit, penyerapan optiknya diukur pada 765 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis (UNICO 2100: USA). Jumlah kandungan fenolik dikira menggunakan keluk penentukuran asid gallic. Hasilnya dinyatakan sebagai mg setara asid gallic per g ekstrak tumbuhan / pecahan kering (mg GAE / g).

Penentuan jumlah kandungan flavonoid
Kandungan flavonoid ekstrak kulit delima dan pecahannya diukur mengikut kaedah yang telah dijelaskan sebelumnya 15. Rutin digunakan sebagai rujukan standard untuk merancang kurva penentukuran. Secara ringkas, 0.2 ml ekstrak / pecahan yang dicairkan (1 mg / ml) atau penyelesaian standard rutin (125, 62.5, 31.2, 15.6, dan 7.8 μg / ml) secara berasingan dicampurkan dengan 0.2 ml 2% aluminium klorida dan 1.2 ml 5% (w / v) kalium asetat. Setelah larutan reaksi diinkubasi pada Suhu Bilik (RT) selama 40 minit, penyerapan optiknya dibaca pada 415 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis (UNICO 2100: USA). Hasilnya dinyatakan sebagai mg rutin setara per g kering (mg RUT / g) berbanding dengan lengkung standard, yang dibangunkan di bawah keadaan yang sama.

Sel kultur dan penyebaran virus influenza
Cell lineMadin-Darby Canine (MDCK) dan virus influenza A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1; PR8) diperolehi daripada Unit Influenza, Institut Pasteur Iran. Sel-sel MDCK ditanam di Medium Modified Eagle’s Medium (DMEM) Dulbecco (Gibco, Amerika Syarikat), ditambah dengan 10% FB (FBS) (Gibco, USA) dan 1% streptomycin penicillin (Gibco, USA) % CO2 atmosfera dan inkubator humidified.

Ujian Cytotoxicity
Kesan ekstrak kulit delima dan pecahannya terhadap fraksi sel-sel MDCK ditentukan menggunakan ujian 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetra zoliumbromide (MTT; Sigma, Amerika Syarikat) kaedah yang dinyatakan 16 dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkasnya, apabila sel monolayer itu berkumpul, sel-sel diinkubasi dengan 200 μl / sampel pelbagai kepekatan ekstrak / pecahan (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 dan 3.1 μg / ml) dalam persampelan  untuk 48 jam. Selepas itu, monolayers sel diinkubasikan dengan 50 μl 1 mg / ml MTT dalam Phosphate-Buffered Saline (PBS) pada suhu 37oC selama 4 jam, dan kemudian dirawat dengan 100 μl isopropanol berasid (0.05 N HCl dalam isopropanol mutlak). Setelah plat digoncang selama 15 minit, penyerapan dibaca menggunakan penapis rujukan pada 640 nm menggunakan pembaca mikplat (StataFax2100, USA).

Ujian pengurangan kesan Cytopathic (CPE)
Apabila sel monolayer bersatu dalam plat-96, sel kultur telah dibilas dengan PBS dan dijangkitkan dengan 100TCID50 virus Influenza A (H1N1) selama 1 jam, dan kemudian virus itu dikeluarkan dan sel-sel telah dirawat dengan siri dua lapisan pelepasan kepekatan nontoxik ekstrak / pecahan (200 μl / sampel) dalam DMEM tanpa serum yang mengandungi 2 μg / ml TPCK-trypsin dan 0.3% BSA. 48 jam selepas jangkitan, daya tahan sel juga ditentukan menggunakan assay MTT  16 Pelbagai kepekatan oseltamivir (10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 dan 0.31 μmol) (Sigma, Amerika Syarikat) digunakan sebagai kawalan positif. Prosedur itu dilakukan dalam tiga peringkat. Kepekatan sitotoksik 50% (CC50) dan 50% kepekatan penghalang (IC50) dikira menggunakan GraphPad Prism 6 (Graph-Pad Software, La Jolla, CA). Indeks selektiviti (SI) dikira sebagai nisbah CC50 hingga IC50.

Hemagglutination assay
Sel-sel MDCK dalam plat 24 dan juga dijangkiti virus PR8 pada 100 TCID50, diinkubasi dengan virus selama 1 jam pada suhu 37 ° C dan berkultur pada DMEM dan TPCK trypsin (0.5 μg / ml; Sigma, Amerika Syarikat) sama ada dengan atau tanpa ekstrak / fractions treatment. Supernatan kultur sel telah ambil 24 dan 48 jam selepas dijangkiti. Lima puluh μl daripada dua kali ganda pencairan serentak supernatan kultur sel telah dicampur dengan jumlah yang sama sebanyak 0.5% Sel Darah Merah (RBC) ayam pada sampel  96 U-bawah untuk 45 minit pada suhu bilik. HA telah dilakukan dengan mengukur faktor pengenceran sampel yang diperlukan untuk melengkapkan ayam RBC agglutination RBC 17.

Titisan virus TCID50
Monolayer sel MDCK dalam piring sampel 24 didapati telah dijangkiti virus PR8 (100 TCID50) selama 24 jam pada 37oC. 50% Dosage Tisu Kultur (TCID50) digunakan untuk titisan virus dalam kultur supernatan 18. Secara ringkas, apabila 90% sel MDCK disediakan dalam 96 plat leper, medium kultur sel telah disedut dan dibasuh dengan PBS dua kali, dan kemudian 100 μl satu siri pelarut 10 kali ganda telah dimasukkan ke dalam sampel  dan dibiarkan untuk mengeram selama 2 hari. Selepas pengeraman, replikasi virus dikesan oleh HA 18–20. TCID50 dikira berasaskan kaedah Reed dan Muench dinyatakan sebagai log10 21.
Analisis statistik
Data dianalisis menggunakan ujian Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbezaan antara kumpulan. Nilai IC50 dan CC50 dikira dengan analisis regresi menggunakan GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Keputusan
Jumlah kandungan fenol dan flavonoid
Keputusan jumlah fenolik dan jumlah kandungan flavonoid dalam ekstrak dan pecahan dibentangkan dalam table 1. Hasil menunjukkan bahawa ekstrak kulit delima adalah sumber terkaya fenolik (233 mg GAE / g) dan flavonoid (60.6 mg RUT / g) kandungan . Kandungan phenolic (692 mg GAE / g) dan flavonoid (93.7 mg RUT / g) tertinggi diperolehi untuk pecahan etil asetat (Table 1).

Aktiviti virus sitotoksis dan anti-influenza A
Berdasarkan keputusan ujian pengurangan CPE dan analisis probit, CC50 ekstrak mentah dan pecahan n-butanol dan etil asetat masing-masing 55.66, 55.61 dan 29.7 μg / ml (Table 2). Analisis menunjukkan bahawa terdapat hubungan langsung yang signifikan antara kepekatan ekstrak / fraksi dan kematian sel (p <0.05, Table 2). Aktiviti antiviral ekstrak dan empat pecahan terhadap virus influenza A / PR / 8/34 telah diuji 48 jam selepas rawatan menggunakan assay pengurangan CPE berasaskan MTT. Keputusan menunjukkan bahawa ekstrak mentah dan pecahan n-butanol dan etil asetat menghasilkan kesan antiviral terhadap virus influenza dengan SIs 8.63, 9.16 dan 5.3 (Table 2).

Figure 2.

Cytotoxicity of pomegranate peel extract and its fractions on MDCK cells. Confluent MDCK cells were exposed to different concentrations of crude extract and its fractions for 48 hr. Cytotoxi-city was measured in MTT assay; experiments were carried out in triplicate.

Inhibisi replikasi virus influenza
Berdasarkan hasil ujian pengurangan CPE (Table 2), ekstrak mentah dan pecahan n-butanol dan etil asetat menjalani ujian antiviral tambahan. Titisan ekstrak HA dan pecahan pada virus influenza dinilai oleh ujian endpoint hemagglutination. Menurut hasilnya, titisan virus menurunkan dos bergantung pada rawatan dengan ekstrak mentah dan pecahan n-butanol dan etil asetat (Table 3).

Untuk mengetahui sama ada ekstrak kulit buah delima dan fraksi n-butanol dan pecahan etil asetat boleh menyebabkan kesan pengambilan pada hasil virus berjangkit, virus itu dititrasi oleh kaedah TCID50. Selaras dengan keputusan HA, pengeluaran virus dikurangkan dengan ketara apabila rawatan dengan ekstrak kulit delima dan n-butanol dan pecahan etil asetat dalam cara yang bergantung kepada dos (p <0.05; Figure 3).

Perbincangan
Delima adalah herba perubatan yang sangat aktif dan penting dalam ubat-ubatan rakyat dan aktiviti antibakteria, antiparasit, apoptotik, antikulat, antiparasiferatif, dan anti-virus yang baru-baru ini telah dikaji 22–24.

Walaupun beberapa kajian melaporkan kesan kawalan buah buah delima terhadap virus herpes, virus influenza, poxviruses, dan virus immunodeficiency manusia 24,25, ini adalah laporan pertama mengenai aktiviti antiviral kulit buah delima. Oleh itu, tujuan kami adalah mengkaji aktiviti anti-influenza ekstrak kulit delima dan pecahannya dalam sel MDCK.

Dalam kajian ini, ekstrak kulit buah delima menghalang replikasi virus influenza A PR8 dalam sel sel MDCK [IC50: kira-kira 6.45 (4.5-9.23)]. Mengikut hasil ujian antiviral untuk mengukur titers HA atau zarah virus berjangkit dalam supernatan budaya, diperhatikan bahawa kulit delima boleh menekan penguatan virus influenza berjangkit. Kerana IC50 ekstrak herba untuk penyakit berjangkit secara konvensional kurang dari 100 μg / ml 26 dan SI lebih dari 4 27, ekstrak kulit delima dengan IC50 6.45 dan SI 8.63 boleh dianggap sebagai agen yang sangat berkesan untuk melawan virus influenza.

Keputusan kami menunjukkan bahawa kulit buah delima dan n-butanol dan fraksi etil asetat memberikan kesan antivirus lebih kuat daripada fraksi lain. Kajian-kajian lain juga menunjukkan bahawa sifat antiviral dari buah delima mungkin disebabkan oleh tanin dan polifenol yang terhidrolisis, terutamanya punicalagin dan asid gallagic, yang juga terdapat dalam ekstrak ini 23. Kajian menunjukkan bahawa daripada empat flavonoid delima, iaitu asid ellagic, asid caffeic, luteolin, dan punicalagin, hanya punicalagin yang mempunyai kesan kawalan terhadap virus influenza. 25. Sebatian polifenol kulit buah delima seperti punicalagin, asid ellagic, dan asid hidroksi-benzoik yang diekstrak dari kedua-dua n-butanol dan pecahan etil asetat mungkin dikaitkan dengan aktiviti antiviral kulit buah delima.

Kesimpulannya
Berdasarkan keputusan kami, kedua-dua pecahan n-butanol dan etil asetat kulit delima, dengan kesan penghambatan yang tinggi terhadap replikasi virus influenza, boleh menjadi ejen anti-influenza yang menjanjikan. Lebih banyak pemahaman mengenai mekanisme tindakan dan komponen semulajadi pecahan ini sepertinya perlu. Keputusan kajian ini juga menunjukkan adanya jumlah polifenol yang tinggi dalam pecahannya. Akibatnya, aktiviti antiviral tumbuhan itu boleh sebahagiannya dikaitkan dengan kandungan polifenolnya.

Pengiktirafan
Kami mengucapkan terima kasih kepada Dr. Fatemeh Fotouhi (Institut Pasteur Iran, Tehran, Iran) kerana memberikan virus. Kerja-kerja ini disokong oleh Universiti Sains Perubatan Shahrekord, Shahrekord, Iran (Grant No.:2489). Penulis bersyukur kepada Pengarah Pusat Penyelidikan Tanaman Perubatan dan Timbalan Penyelidikan dan Teknologi Shahrekord University of Medical Sciences, Shahrekord, Iran.

Hasil Penyelidikan oleh:

Artikel asal: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6925405/

Conflict of Interest

The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this paper.

References